控制融合蛋白生產中的糖基化生成有潛力的biobetter

　　制藥公司的管線充滿了生物藥物。許多是創新的治療蛋白質，但越來越多的代表生物仿制藥和biobetters（圖1）（1）。biobetters通常被定義為“基于創新生物制品，但具有改進的性質”（2）。 他們的發展受益于已知的治療方法和作用機制，從而導致低風險，快速通向臨床，從而降低成本。優勢是通過延長半衰期（t1/2），改善功效，降低免疫原性或毒性（3）。一些理想的改進，例如增強的藥代動力學，可以通過將其他結構域與目標蛋白基因連接來獲得（4）。例如，幾種半衰期得到改善的融合蛋白最近已經獲得市場批準，被用作凝血因子IX（FIX）或胰高血糖素樣肽1（GLP-1）（表1）。

　　糖基化

　　或者，可以應用糖基化修飾來增強循環時間。糖基化是真核細胞中的翻譯后修飾，其影響許多生物相關功能，例如藥代動力學，藥效學和免疫原性。因此，在制造過程中，必須正確控制糖基化。糖基化蛋白質含有與天冬酰胺側鏈中的氮N-連接的碳水化合物或與絲氨酸或蘇氨酸中的氧O-連接的碳水化合物。在穿過內質網（ER）和高爾基體時，N-連接的聚糖以三步法連接。合成前體低聚糖，然后轉移到天冬酰胺作為活化聚合物嵌段，最后酶修剪。這一步對培養條件非常敏感，因此N-聚糖需要更徹底的分析。該過程可以區分甘露糖含量高的聚糖，含有高度唾液酸的復雜寡糖和混合型（圖2）。

　　與Asn的N-連接糖基化需要天冬酰胺-X-絲氨酸 -蘇氨酸（Asn-X-Ser/Thr）的識別基序，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。 O-連接的糖基化不需要共有序列，而是需要更依賴于Ser或Thr的二級結構和可及性。 而且，O-連接的糖在高爾基體中依次作為單一的單糖連接。 隨后通過糖基轉移酶修飾導致成熟的O-聚糖。

　　O-連接的低聚糖中的末端糖通常是唾液酸。 唾液酸有幾種變體，但只有NANA（N-乙酰神經氨酸）對半衰期有正面影響。 注意N-或O-連接聚糖的最終結構與蛋白質序列無關，而是取決于正確的三維結構以及必需酶的表達和ER和高爾基體中糖底物的可用性（5）。 這最終導致聚糖結構的異質性，增加了下游加工（DSP）和分析努力以產生均勻和良好表征的藥物物質。

　　糖基化的作用

　　半衰期受糖基化的影響。大的寡糖結構的添加可以顯著增加糖蛋白的流體動力學半徑，從而降低腎過濾的水平，這是尺寸依賴性的。唾液酸對半乳糖殘基的完全封閉實現三個功能：在腎小球濾過中的排斥由于負電荷，通過無唾液酸糖蛋白受體結合阻止消除，并增加流體動力學半徑，從而更大程度上防止尺寸依賴性過濾（6）。因為唾液酸存在于N-連接的或O-連接的聚糖上，所以兩種變體都可以顯著延長半衰期。

　　例如，依那西普的循環時間與TNFα受體結構域的唾液酸化程度直接相關（7）。對于BR3-Fc-融合蛋白的O-連接聚糖以及IL-23R-Fc-融合蛋白，CTLA4-Ig融合蛋白，LFA3-Fc-融合蛋白和TNFαRI-Fc-融合蛋白中的N-連接聚糖的唾液酸化表現出相同的效果（8）。

　　糖基化也可以減少半衰期。對于甘露糖含量高的案例，蛋白質通過巨噬細胞和肝細胞上的甘露糖受體迅速從血液中清除。具體而言，M5變體種類被清除最快（9）。另一方面，具有高甘露糖含量的糖蛋白可以用于治療性蛋白質靶向特定的細胞類型。用于溶酶體貯積病的酶替代療法依賴于該原理，特別是針對巨噬細胞。第一種酶藥物必須進行化學改造，但是現在表達系統的正確選擇可以提供具有高甘露糖含量的糖蛋白（10）。

　　抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）是適應性免疫應答的一部分，并且描述了免疫細胞對其表面抗原與抗體結合的靶細胞的攻擊。抗體和效應細胞之間的連接取決于在IgG的CH2結構域的重鏈  -在免疫球蛋白與Fcγ受體相互作用的區域的Asn297位置存在某種N-連接的糖基化。在此位置不存在糖基化減少了與FcγRI的結合親和力，并完全消除與FcγRII和FcγRIII的結合。然而，如果僅從聚糖中去除巖藻糖，則抗體顯示出對FcγRIIIa 增加的親和力，因為在抗體上的碳水化合物和受體之間沒有空間位阻（11）。

　　末端半乳糖是補體依賴性細胞毒性（CDC）活性的關鍵元件。 CDC與利妥昔單抗重鏈中的半乳糖含量成比例地增加，而與C1q的親和力已經顯示出從G0增加到G2糖的兩倍（12）。沈等人描述了一種biobetter版本的依那西普，它能改善與膜結合的TNFα的結合，并表現出作為新的作用模式的ADCC活性[13]。該發現可以導致進一步改進的受體陷阱和其他糖基化工程化的含Fc結構域的融合蛋白而不改變氨基酸序列。

　　毒性：在微生物或植物毒素與靶向部分（如單鏈抗體）融合以產生免疫毒素的情況下，研究顯示非糖基化的白喉毒素比具有N-連接的聚糖的天然毒素的毒性高12倍。因此，識別序列中的天冬酰胺被丙氨酸取代以獲得毒性融合蛋白（14）。

　　免疫原性：在糖基化期間添加的大量碳水化合物結構可能會使免疫原性肽表位免受免疫系統的識別。然而，非人或非哺乳動物的聚糖如高甘露糖N-聚糖或N-羥乙酰神經氨酸（Neu5Gc）和半乳糖-α1,3-半乳糖（α-Gal）會引起免疫反應。 α-Gal表位或Neu5Gc的結構已被描述為抗藥物抗體（ADA）的靶標（15）。

　　溶解性和穩定性：疏水性蛋白質斑塊提供了聚糖的屏蔽作用。糖結構的高親水含量增加了溶解度。它也有助于熱穩定性，因為熱誘導展開后蛋白質通常趨向于通過疏水斑塊聚集（16）。另一個保護聚糖結構的功能是蛋白酶的空間位阻，從而限制了降解（17）。圖3顯示了典型的聚糖結構及其功能。

　　控制糖基化

　　分子設計：操縱聚糖含量的第一步是通過適應氨基酸序列。Darbepoetin alfa（Aranesp）是含有5個（而不是3個）N-連接的糖基化位點的人促紅細胞生成素（EPO）的高糖基化類似物。

　　這種新的變體展現出相對舊的變體更低的pI（3.3 代替4.0），更大的分子量（37kDa代替30kDa）和增加的碳水化合物含量（51％代替40％）。半衰期從8.5小時顯著增加至26.3小時。雖然五個氨基酸發生了變化，但ADA的數量并沒有增加，這可能是由于聚糖對新表位的屏蔽（18）。

　　類似的情況是凝血因子VIIa（FVIIa）的糖工程（BAY 86-6150）。在FVIIa的原始序列中引入了兩個以上的N-連接的聚糖連接位點。這種修飾提高了野生型FVIIa半衰期的兩倍至三倍半衰期（19）。

　　可以添加具有多個糖基化位點的肽序列。這個概念常用的構建模塊是人絨毛膜促性腺激素（hCG）-β-亞基的C-末端肽（CTP）。該域包含四個O-連接的寡糖識別位點。盡管它的名字，CTP可以融合到N-或C-末端或兩個末端。在一個實例中，將一個CTP單元融合到氨基末端，并將兩個CTP結構域添加到EPO的羧基末端。由于來自CTP的84個氨基酸和大量的O-連接的寡糖，分子量增加到57kDa。半衰期增加了三倍，沒有引發免疫反應（20）。相同原理通過在C端連接CTP應用于FVIIa。這種修改導致FVIIa-CTP（MOD-5014）（21）的三到五倍的半衰期改善。

　　另一種方法是使用聚唾液酸（PSA）。這通過將NCAM的PSA載體結構域融合到scFv的C端并在含有聚唾液酸轉移酶的轉基因HEK293細胞中表達該構建體來示例。聚唾液酸化使流體動力學半徑增加了三倍，導致循環半衰期提高了12倍（22）。

　　通常，短肽片段在融合蛋白的結構域之間起著靈活的連接體的作用。 甘氨酸-絲氨酸（Gly-Ser）接頭中的絲氨酸是O-連接的木糖基化的靶標。 這種聚糖可以是免疫原性的，所以通過用脯氨酸（Pro）取代鄰近Ser的一個Gly來改變基序（23）。 在另一種情況下，去除O-連接的糖基化位點以恢復融合蛋白中抗IL17a肽的適當活性（24）。 在一項關于IgA鉸鏈肽的研究中，研究人員證明O連接糖基化的增加降低了接頭的靈活性并限制了接頭的構象（25）。 然而，將糖基化位點引入接頭結構域支持復雜的融合蛋白的正確折疊，因為它減慢蛋白質加工并包括細胞內質量控制，從而產生穩定的蛋白質。 圖4顯示了典型的構建塊。

　　細胞系和應變

　　工程：下一級糖基化控制是宿主細胞系的選擇。典型的生產宿主如中國倉鼠卵巢（CHO），人類胚胎腎（HEK293），PER.C6，NS0和SP2/0細胞在其聚糖模式中顯著不同（表2）。 CHO細胞廣泛用于制造蛋白質，因為它們遞送人類型聚糖。然而，它們不能產生α-2,6-唾液酸化和α-1,3/4-巖藻糖基化，甚至不能連接一些非人類和免疫原性的聚糖如Neu5Gc和α-Gal。圖5顯示了宿主細胞的差異。

　　宿主的一些缺點可以通過菌種工程來消除，所述菌種工程是加入或去除糖基轉移酶。不存在于人類中的酶，例如α-1,3-半乳糖基轉移酶或CMP-Neu5Ac羥化酶尤其應該被敲除。消除CHO細胞中的α-1,6-巖藻糖基轉移酶（FUT8）活性導致聚糖中不存在巖藻糖。這對于抗體和Fc融合蛋白來提高其ADCC能力是有益的（26）。

　　通過引入β1,4-甘露糖糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基轉移酶III（GnTIII），可以改善ADCC，其阻斷巖藻糖基化并導致平分天線。通過共表達微生物唾液酸酶A（其切割末端唾液酸殘基）可以增強ADCC功能（27）。然而，通過RNA干擾消除CHO細胞中的唾液酸酶活性增加了唾液酸的總量（28）。通過過表達α-2,6-唾液酸轉移酶可以恢復CHO細胞產生α-2,6唾液酸化的能力（29）。唾液酸化也可以通過引入一個基因，例如β-1,4半乳糖轉移酶產生末端半乳糖的基因，然后轉移唾液酸來提高（30）。

　　上游處理（USP）

　　聚糖結構可受生物反應器中生長條件的影響。具有效果的典型物理化學過程參數是pH，溫度，CO2和銨離子濃度（表3）。滲透壓的滴定可以用來控制巖藻糖基化的程度。重要的酶輔因子應該以足夠的量存在。具體而言，錳和鐵促進增加的糖基化。其他補料或培養基組分如典型的碳源葡萄糖，其被半乳糖，甘露糖或其它糖基化前體取代，對聚糖結構有影響，包括尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc），尿苷二磷酸-半乳糖（UDP-Gal）和胞苷一磷酸-唾液酸（CMP-SA）。

　　培養基中的添加劑也可以在上游加工期間引導糖基化。添加丁酸鈉后，融合蛋白中Neu5Gc的免疫原性含量可降低50％。此外，后期的溫度變化和NaOH控制的pH可以支持低Neu5Gc水平（31）。一項研究顯示氫化可的松對糖皮質激素受體的激活改善了依賴于劑量的Fc-融合蛋白的唾液酸化程度（32）。

　　除了在基因水平的糖工程，不需要的酶活性可以被特定的抑制劑阻斷。例如，巖藻糖基轉移酶可被氟化巖藻糖類似物（33）或某些活性染料（34）所阻斷。硫酸葡聚糖已經解決了唾液酸酶，而甘露糖苷酶1抑制劑被用來產生高甘露糖結構（35）。

　　下游處理

　　DSP通常以無細胞上清液開始。理想情況下，為了防止細胞內糖苷酶特別是可降低唾液酸含量的唾液酸酶的釋放，不發生細胞裂解在收獲過程中。盡管在USP期間有很多控制糖基化的可能性，通常仍然存在一些異質性。這些不同的異構體可以根據電荷變化在陰離子交換樹脂上以緩梯度進行分離。負電荷主要由唾液酸貢獻。由于其單獨的疏水性程度，高度帶電的形式也可以與不太強烈的糖基化變體區分開。該原理應用了高度糖基化的Fc融合蛋白，可以通過離子交換色譜和疏水相互作用色譜（HIC）的組合進行純化（36）。

　　一般來說，聚糖可以比不含偶聯寡糖的天冬酰胺更具親水性，因此與HIC樹脂結合更緊密（37）。在某些情況下，羥基磷灰石（HTP）已被用于區分聚糖變異體。例如，α1酸性糖蛋白（AAG）的六種亞型可以在低pH下用HTP和磷酸鹽梯度分離（38）。 用于分析目的的樹脂庫甚至更大，還含有高特異性的親和配體，例如凝集素或二氧化鈦（39）。

　　展望：進度和優化

　　在過去的幾十年中，在了解糖基化機制及其作用方面取得了巨大進展。一般而言，biobetter從優化聚糖的各種方法中受益（圖6）。策略重點是延長循環半衰期，可以觀察到一種改進功能的趨勢。在融合蛋白的例子中，我們很可能會看到增強的fc融合蛋白，但還有一個警告：在這種情況下，糖化工程與能夠產生類似效果的氨基酸交換競爭。生物制品行業的競爭日益激烈（圖1和表1），表明不同的分子版本可以解決相同的市場問題，并且存在著很小的分化潛能。在許多情況下，糖基化是需要嚴格控制參數的關鍵質量屬性。由于優化糖蛋白的復雜性和多種可能性，制造商應根據設計原則組織所有的努力，使系統的微調達到預期的效果。