三篇NatureMedicine：基因療法治療遺傳病或可實現長期有效

　　精準醫療使醫療技術獲得了飛躍式的發展進步，多項研究成果表明，基于CRISPR/Cas9的基因療法在遺傳病治療中有很大的應用前景。2017年，Spark公司的創新基因療法Luxturna獲得美國FDA批準上市，用于治療患有特定遺傳性眼疾的成人和兒童患者，為基因療法研究注入了一劑強心劑。

　　2月18日，《自然醫學》雜志同期發表了三篇基因療法相關文章，展示了基于CRISPR/Cas9的基因療法治療罕見遺傳病的突破性研究成果。

　　在杜氏肌營養不良（DMD）基因治療長期療效及安全性研究中，杜克大學的研究人員已經證明，基于CRISPR的基因療法可以在一年的時間里，安全、穩定地糾正小鼠體內的DMD。研究中也觀察到了免疫反應和脫靶效應，但目前的研究結果顯示該療法是安全有效的，后續仍需進行仔細地監測驗證研究。接下來，我們重點了解一下這項研究。

　　該研究由杜克大學Charles Gersbach教授領導完成，其研究團隊自2009年起就致力于DMD的基因療法研究開發。DMD由抗肌萎縮蛋白（Dystrophin）的編碼基因突變導致。如果編碼抗肌萎縮蛋白的一個或多個外顯子發生突變，機體就無法產生抗肌萎縮蛋白，進而導致肌肉緩慢地斷裂和退化。基于該機制，Gersbach教授研究團隊開發了一種基于CRISPR的基因療法（AAV為載體）。該療法是利用CRISPR/Cas9切斷抗肌萎縮蛋白外顯子周圍發生突變的基因，再利用人體的自然DNA修復系統將剩下的基因重新“縫合”在一起，從而產生一個縮短的、具有正常功能的抗肌萎縮蛋白編碼基因。

　　在動物模型試驗中，研究團隊選用了成年和新出生的DMD小鼠模型。研究人員為DMD小鼠模型實施了單劑量靜脈注射的上述基因療法，并進行了追蹤。前8周研究結果顯示，小鼠的抗肌萎縮蛋白功能得到恢復，肌肉力量增強，表明該基因療法確實有效。

　　此前的DMD治療研究都集中于抗肌萎縮蛋白的短期恢復，通常在治療后4-8周進行評估。然而，基因編輯會導致永久性的基因改變，所以探索該基因療法可能帶來其他后果，以及療效的持久性至關重要。在接下來的一年中，研究人員對注入小鼠體內的CRISPR系統編輯效果進行了檢測跟蹤。令人驚喜的是，研究結果表明，該療法不僅成功編輯了小鼠體內的缺陷基因，并使其獲得了長期表達抗肌萎縮蛋白的能力，所有的老鼠在治療一年后都表現良好！

　　除了療效，基因編輯的脫靶問題也非常惹人關注。為了全面研究該基因療法產生的所有基因編輯事件，研究團隊采用了一種DNA測序方法，該方法可報告任何基因編輯類型。研究發現，除了預期的目標外顯子外，還有許多種其他編輯類型，包括來自CRISPR/Cas9系統病毒載體的高水平DNA序列插入。

　　經過對組織類型和CRISPR輸送劑量進行分析，研究人員發現，多達一半的基因編輯會導致這些脫靶效應。雖然該結果令人驚訝，但目前的研究數據顯示，這些非預期的DNA序列變化并不會影響該基因療法對DMD的治療效果和安全性。雖然如此，研究人員表示，任何非預期的基因編輯結果都有潛在的價值，這些基因編輯事件在未來研究的方法設計、識別和減少脫靶效應中都有重要作用。

圖：未治療DMD小鼠模型（左）和使用該基因療法治療一年后的DMD小鼠模型（右）。綠色表示抗肌萎縮蛋白基因表達水平較高，黑斑表示來自小鼠的T細胞響應細菌Cas9蛋白，表明存在免疫反應。

　　此外，已有研究表明小鼠的免疫系統可對Cas9產生反應，這可能干擾CRISPR的編輯效果。為此，研究團隊還監測了小鼠模型對Cas9蛋白產生的所有免疫反應。研究人員在成年小鼠模型中觀察到了抗體和T細胞對Cas9的反應，但這些免疫反應似乎都沒有在小鼠體內產生任何毒性，且沒有影響治療效果；新出生的小鼠模型則沒有類似的免疫反應。同時，研究人員也在開發新的策略來限制Cas9的表達或在短時間內僅將CRISPR/Cas9系統輸送到肌肉細胞，以減少可能的免疫反應。

　　與該研究同期發表的還有另外兩篇文章，都是針對早衰綜合征（HGPS）的基因治療展開，文章題目分別為“Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome”和“Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome”。前一項研究由西班牙和英國科學家合作完成，后一項由美國索爾克生物研究所科學家領導完成。

　　HGPS是由LMNA基因點突變引起的一種罕見致死性遺傳病。該病的患者自童年開始就快速地衰老，目前還沒有針對HGPS的有效治療。已有研究發現，Lamin A蛋白的編碼基因LMNA的突變，促使機體產生了孕激素有毒異構體，這是HGPS的主要致病原因。

　　在西班牙科學家領導的研究中，研究人員探討了一種基于CRISPR/Cas9基因療法的有效性，該方法通過在LMNA基因中引入移碼突變，阻斷Lamin A蛋白和孕激素的積累，來恢復HGPS引起的細胞成分的變化。研究結果顯示，該基因療法可廣泛地改善HGPS小鼠的表型，并延長壽命。

　　在由美國科學家領導的最新研究中，研究人員通過單劑量全身性注射AAV病毒介導的CRISPR/Cas9組分，來降低小鼠模型中的Lamin A蛋白/孕激素水平，以抑制HGPS的發生。研究結果顯示，該基因療法改善了HGPS小鼠的健康狀況，并延長了小鼠的壽命。以上兩項研究均展示了CRISPR/Cas9在HGPS小鼠模型中的治療效果，也為在其他目前無法治愈的罕見疾病中使用CRISPR/Cas9開辟了道路。

　　基因療法已經引起了各國科學家和跨國制藥巨頭的關注。2018年12月1日，美國FDA已經接受Editas Medicine公司為EDIT-101遞交的IND申請，允許該公司開展使用CRISPR基因編輯手段治療Leber先天性黑朦10型患者（LCA10）的臨床試驗。EDIT-101有望成為世界上第一款在人體內使用的CRISPR療法。此外，還有多項針對艾滋病、血友病、地中海貧血、心血管病、腎病、肺病等疾病的基因療法研究正在進行，部分已進入臨床試驗階段。希望隨著科學技術的進步，更多安全有效的基因療法能夠開發出來，為推進科學和人類健康進步貢獻力量。

　　參考資料：

　　1. Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy

　　2. Single CRISPR treatment provides long-term benefits in mice

　　3. Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome

　　4. Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome