周強組解析首個人源氨基酸轉運體LAT1–4F2hc復合體結構

　　L 型氨基酸轉運體1，簡稱LAT1（也被稱作SLC7A5），屬于反向轉運蛋白，能向胞內轉運不帶電氨基酸，此外還參與藥物的吸收、甲狀腺激素及激素前體物質如L-DOPA的跨膜運送。LAT1和 LAT2（SLC7A8）同屬于SLC7 家族，其介導氨基酸反向協同轉運過程不依賴于鈉離子，其中LAT1也不依賴于pH。

　　LAT1和LAT2具有相似的胞內胞外底物選擇性，LAT1傾向于轉運較大的不帶電氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和組氨酸【1】，LAT2的選擇性更廣，但一般而言底物親和力更低。在組織特異性上，兩者表達也有差別，另外LAT1在多種腫瘤細胞中檢測到表達上調，使其成為潛在的抗腫瘤藥物靶點【2】。在結構上，LAT1通過二硫鍵與4F2 細胞表面抗原重鏈糖蛋白（4F2 cell surface antigen heavy chain，也叫SLC3A2）共價連接形成LAT1-4F2hc復合體【3】。盡管已有工作解析了細菌來源的LAT1-4F2hc同源晶體結構及人源的LAT2-4F2hc負染的低分辨結構，但人源LAT1-4F2hc復合體亞基之間的相互作用及轉運的工作機制仍未明了。

　　2019年3月14日，西湖大學生物學研究所周強研究員團隊在Nature發表了題為Structure of the human LAT1–4F2hc heteromeric amino acid transporter complex的論文（第一單位為清華大學），該研究利用冷凍電鏡技術，研究者首次解析了人源LAT1–4F2hc復合體整體分辨率3.3?的高分辨結構，及LAT1–4F2hc與抑制劑2-amino-2-norbornanecarboxylic acid (BCH)結合的3.5?的結構。

　　研究者在HEK293F細胞中外源大量表達人源LAT-4F2hc蛋白，純化后蛋白用于冷凍電鏡樣品制備及體外的功能學研究。首先蛋白被重構入脂質體進行體外轉運實驗，通過檢測復合體對同位素標記的亮氨酸[3H]leucine的吸收速率，實驗測定了LAT1-4F2hc催化轉運的Km值，確定體外表達純化蛋白具有活力。其他LAT1底物與[3H]leucine的競爭性實驗表明，[3H]leucine的轉運活力可被苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、酪氨酸、L-DOPA、組氨酸、甲硫氨酸、BCH和異亮氨酸抑制，抑制程度依次降低。同時研究者單獨純化了LAT1蛋白，進行了體外重構脂質體的轉運實驗，發現LAT1單獨幾乎無轉運活性，有力地說明了4F2hc在轉運過程中發揮著重要作用。

　　該工作解析了人源LAT1–4F2hc復合體整體分辨率3.3?的高分辨結構，這是已發表工作中，冷凍電鏡解析的高分辨無對稱性的最小膜蛋白，可見區部分不到100kDa。此外研究者還收集了加入抑制劑JPH203的蛋白樣品的數據，功能實驗證明了JPH203對重構入脂質體的LAT-4F2hc復合體的抑制，但3.3?結構中并沒有看到抑制劑的密度。三個結構HAT + BCH，HAT + JPH203， apo-HAT（未外加藥物的結構）整體構象幾乎一致，通過與apo-HAT密度比較，研究者在HAT + BCH結構中發現一處可以較好匹配BCH分子形狀的密度（下圖）。

　　LAT1–4F2hc復合體整體結構呈現朝胞內打開的構象，4F2hc上有四個糖基化位點。研究者看到了BCH的密度，對BCH周圍有相互作用的氨基酸突變后，發現帶有點突變的復合體對亮氨酸的轉運能力下降，這和根據與GkApcT和 AdiC轉運體序列比對結果推測的轉運路徑相符，根據與其他氨基酸轉運體的序列比對結果與對結果分析，找到Tyr117, Phe252, Trp257, Asn258, Tyr259和 Arg348等氨基酸，繪制了可能的氨基酸轉運路徑。

　　對結構的分析中發現，4F2hc與LAT1除形成二硫鍵外，還有多個相互作用的界面，由多個氨基酸參與形成，有意思的是，這些有相互作用的氨基酸均在遠離底物轉運路徑，但某些關鍵相互作用氨基酸發生突變，會顯著降低氨基酸的轉運能力，推測4F2hc像一個支架，支持底物轉運過程中LAT1的變構。

　　基于對高分辨結構的解析及功能實驗驗證，對LAT1–4F2hc復合體可能的工作機制提出了如下的模型：

　　總的來說，該工作中LAT1-4F2hc復合體高分辨結構清晰的密度，為疾病相關突變的研究提供了結構基礎，對LAT1-4F2hc轉運底物機制的探究具有重要意義，LAT1-4F2hc與抑制劑BCH結合的構象為針對LAT1-4F2hc的抗癌藥物研發提供幫助。

　　據悉，西湖大學生物學研究所周強研究員為此文的通訊作者，清華大學博士生鄢仁鴻、趙馨為共同第一作者。

　　通訊作者簡介：

　　周強（1982 -），黑龍江齊齊哈爾人。2000-2004年本科就讀于清華大學，獲學士學位。2004-2012年博士師從隋森芳院士就讀于清華大學，獲博士學位。博士畢業后繼續留實驗室從事博士后研究工作。2015年博士后出站后在清華大學醫學院顏寧教授課題組任副研究員。2019年初將加盟西湖大學擔任西湖學者、特聘研究員，開展獨立研究工作。（信息來源于西湖大學官網）

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1038/s41586-019-1011-z

　　參考文獻

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　　Kanai, Y. et al. Expression cloning and characterization of a transporter for large neutral amino acids activated by the heavy chain of 4F2 antigen (CD98). J. Biol. Chem. 273, 23629–23632 (1998).

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　　Yanagida, O. et al. Human L-type amino acid transporter 1 (LAT1): characterization of function and expression in tumor cell lines. Biochim. Biophys. Acta 1514, 291–302 (2001).

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　　del Amo, E. M., Urtti, A. & Yliperttula, M. Pharmacokinetic role of L-type amino acid transporters LAT1 and LAT2. Eur. J. Pharm. Sci. 35, 161–174 (2008).