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  • 發布時間:2019-03-25 14:47 原文鏈接: 質粒DNA的提取與純化——堿解法

    質粒DNA提取可以:

    (1)快速純化質粒;(2)用于測序、體外轉錄與翻譯、限制性內切酶消化、細菌轉化等分子生物學實驗。

    一、實驗目的與原理


    質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子,是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作,進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。


    提取質粒的基本步驟分為三步:


    ①細菌的培養和質粒的擴增


    ②細菌菌體的裂解


    ③質粒DNA的純化


    本實驗采取的菌體裂解方法為堿解法,質粒純化方法為梯度離心法。


    二、材料與試劑


    1、材料:大腸桿菌


    2、儀器:超凈工作臺,培養箱,搖床,恒溫水浴鍋,臺式離心機,取液器一套,低溫冰箱,冷凍真空干燥機,電泳儀,水平電泳槽,紫外觀測儀


    3、試劑:


    Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)
    10 mM EDTA(pH8.0)
    50 mM葡萄糖
    高壓滅菌,4℃保存
    Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 現配現用
    Solution III 5 N KAc pH4.8
    高壓滅菌,4℃保存
    3 M NaAc PH5.2, 高壓滅菌,4℃保存。異丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,無水乙醇,70%乙醇,LB培養基,電泳試劑


    三、操作步驟


    1、細菌繁殖


    LB培養基,2 ml/20ml,37℃,200rpm,搖一搖,過夜


    2、離心10 min,5000 rpm, 4℃;棄上淸液


    3、沉淀(菌體細胞)預冷的TES緩沖液洗滌,離心10 min,5000 rpm, 4℃


    加入預冷的1 ml Solution I,冰浴,10 min


    4、重新懸浮,加入150 ul溶菌酶母液,室溫放置5 min


    5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴,5 min


    6、加入0.9 ml預冷乙酸鉀,混勻,離心10 min,12000 rpm, 4℃


    7、加入1.5 ml異丙醇,-20℃冰箱內放置15 min


    8、離心10 min,12000 rpm, 4℃


    9、取沉淀,懸于400 ul TE緩沖液中


    10、加入40 ul,3 M NaAc


    11、酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀


    12、離心10 min,12000 rpm, 4℃


    13、取沉淀,冷凍干燥,再懸浮于50 ul TE緩沖液中。


    14、電泳檢測提取DNA的質量



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