BAC／PAC文庫的構建

EcoRⅠ消化的基因組DNA載體DNA電轉化感受態細菌細胞

5 X 緩沖液EDTA蛋白水解酶KPMSF 緩沖液Not I 限制酶和緩沖液瓊脂糖溶液0.5 X TBE 緩沖液

SOC 培養基LB 平板LB 培養基水浴鍋激孔透析膜離心管軌道混合器自動質粒隔離系統軟質塑料96孔板

1.目標區域的大小

（1）如果基因組的目標區域很小（小于50kb），那么可以選擇黏粒載體甚至是λ噬菌體載體。利用現有的商品化的黏粒載體、高效率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株，研究者可以方便的構建黏粒載體文庫。

（2）如果基因組的目標區域比較大，那么P1、PAC或者BAC就比較合適了。P1操作比較困難，PAC相對簡便。BAC載體也是很好的選擇，研究者可以利用現有的成熟產品來構建BAC文庫，比如EPICENTRE公司的一系列BAC載體及配套試劑盒。

（3）如果目標區域非常大（大于250kb），那么YAC載體就是首選了。不過，應用YAC載體來構建基因組文庫，操作非常繁瑣困難，一般由專門的公司來完成。

2.篩選文庫的難易程度

黏粒載體一般使用傳統的濾膜影印雜交來篩選，但是這種方法對于構建區域圖譜及疊連群來說既費力又浪費。大容量載體文庫，如P1、PAC、BAC、YAC，以二維陣列保存，既可以用傳統的單拷貝的探針雜交法篩選，又可以用PCR進行多克隆的群體篩選。而且，使用高容量載體構建文庫，可以減少染色體步查的步驟。

3. 載體拷貝數的考慮

當把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時，克隆DNA會發生重組，從而影響克隆序列的保真性和穩定性；而單拷貝載體的低產量DNA是高通量分析的瓶頸。這個矛盾常常困擾著研究者。而EPICENTRE's CopyControlTM 克隆系統是對這些困難的最好的解決方案。CopyControlTM技術整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優點。單拷貝載體能提高插入片段的穩定性，而且拷貝載體能在誘導劑的作用下，即時擴增出高拷貝數的克隆而獲得高產量的DNA。

四、將基因組DNA片段連接入載體

使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體。商業化載體已經經過預處理，可以直接使用，無需內切酶消化及脫磷酸化處理。連接反應體系以100ul為宜。

注意：BAC載體連接完以后，需要將連接產物做脫鹽處理，除去連接反應緩沖液里的鹽分。

五、將重組載體轉入宿主細胞

1. 如果使用Epicentre試劑盒構建黏粒文庫，需要用Epicentre MaxPlax Lambda Packaging Extracts 來包裝上述的連接反應產物，測定包裝好的黏粒克隆的滴度，然后轉染Epicentre EPI300-T1?Plating Strain。挑出重組子，鑒定插入片段的大小。如果文庫的大小和質量都令人滿意的話，就可以鋪板進行文庫篩選，或者擴增、保存文庫。

2. 如果使用Epicentre試劑盒構建BAC文庫，應選擇電轉法，可以選擇Epicentre TansforMaxTM EPI300TM Electrocompetent E.coli 作為宿主，將上述連接產物轉入細菌，涂板長出克隆后。獲得克隆，研究者需要對BAC克隆的大小進行評估，確定文庫大小是否能夠滿足要求。Epicentre 文庫構建試劑盒中的EPILyse和EPIBlue，快速裂解克隆并電泳，可以方便的鑒定出BAC克隆的大小，從而估計出BAC文庫的大小。如果文庫大小合適，那么這個文庫就可以進行后續的操作了。

六、文庫克隆數的確定

基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆，來保證文庫的代表性。一般使用如下的經驗公式來確定：

N = ln （1-P ） / ln （1-f ）

P是希望得到的覆蓋率，f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值，N是所需的克隆數。

舉例來說，用BAC載體構建人類基因組文庫，人類基因組大小為3 x 109 bp, 插入片段大小為100kb，希望覆蓋率99%，那么所需要的BAC克隆數為：

N = ln （1 - 0.99） / ln （1 - [106bp / 3 x 109 bp]） = -4.61 / -3.33 x10^-6= 138,298