在細胞中表達的 RNA 除了我們所熟悉的 mRNA 以外，還有大量不編碼蛋白質的非編碼 RNA（noncoding RNA，ncRNA），非編碼 RNA 在細胞中起著非常重要的作用，如 rRNA 和 tRNA 維持著基因的表達，還有一部分則起著調控基因表達的作用。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | 在細胞中表達的 RNA 除了我們所熟悉的 mRNA 以外，還有大量不編碼蛋白質的非編碼 RNA（noncoding RNA，ncRNA），非編碼 RNA 在細胞中起著非常重要的作用，如 rRNA 和 tRNA 維持著基因的表達，還有一部分則起著調控基因表達的作用。 |
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| 實驗材料 | 寡核苷酸乙腈ImpAp17.91XDEPC糖原T4 RNA 連接酶反轉錄酶dNTPDTTEDTAT4 DNA 連接酶BanⅠ限制性內切核酸酶Taq 酶M13F 引物M13R 引物 |
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| 試劑、試劑盒 | 混合液沉淀液上樣液乙醇T4 RNA 連接酶緩沖液重蒸水KOHTris-HClT4 RNA 連接酶緩沖液NEB 緩沖液溶膠溶液 |
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| 儀器、耗材 | TOPO TA 克隆試劑盒 |
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| 實驗步驟 | 一、材料與設備
1. 寡核苷酸。
2. 乙腈。
3. 混合液 A：0.5 mmol AMP（5' 磷酸化）溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。
4. 混合液 B：1 mmol 三苯磷，1 mmol 2，2'- 雙吡啶二硫化物，2.5 mmol 咪唑，0.90 ml 三乙胺，溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。
5. 沉淀液：9 mmol NaClO4，225 ml 丙酮，115 ml 乙醚 ( 無水乙醚)。
6. 25 mmol MgCl2。
7. 50 mmol/L ImpA ( ImpA 合成見操作方法第2部分）。
8. 0.2 mmol/L p17.91X ( 見操作方法第1部分，即 3' 末端封閉的 3' 端供體寡核苷酸）。
9. 上樣液：8 mol/L 尿素，0.5 mmol/L EDTA。
10. 乙醇。
11. DEPC。
12. 糖原。
13. 5X T4 RNA 連接酶緩沖液：250 mmol/L Hepes ( pH 8.3 )，50 mmol/L MgCl2， 16.5 mmnol/L DTT，30 μg/ml BSA，41.5% 甘油。
14. T4 RNA 連接酶。
15. 反轉錄酶（invitrogen superscript RT）。
16. 重蒸水。
17. 10X dNTP( 1X dNTP 含有每種 dNTP 各 0.2 mmol/L）。
18. 100 mmol/L DTT。
19. 0.1 mol/L EDTA。
20. 1 mol/L KOH。
21. 1 mol/L Tris-HCl ( pH 1.0 )。
22. 0.2 mol/L MgCl2。
23. T4 DNA 連接酶。
24. 5X T4 RNA 連接酶緩沖液：250 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，50 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，5 mmol/L ATP，125 μg/ml BSA。
25. BanⅠ限制性內切核酸酶。
26. 10X NEB 緩沖液 4：500 mmol/L 乙酸鉀，200 mmol/L Tris-HAc，100 mmol/L 乙酸鎂，10 mmoI/L DTT。
27. 溶膠溶液：20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA pH 8.0。
28. TOPO TA 克隆試劑盒。
29. Taq 酶。
30. M13F 引物：5' GGTAACGCCAGGGTTTTCC 3'。
31. M13R 引物：5' CAGGAAACAGCTATGACC 3'。
32. 1X 上樣液：8 mol/L 尿素，0.5 mol/L EDTA。
二、操作方法
1. 寡核苷酸設計
(1) 用于 RNA 克隆的寡核苷酸（下劃線部分為 BanⅠ酶切位點 G↓GYRCC）：
3' 端供體寡核苷酸：17, 91-pCTGTAGGCACCTCAAx（x：DMT-O-C3-CPG）。
5' 端受體寡核苷酸：17.93R ATCGTaggcacctgaaa（小寫部分為 RNA，大寫部分為 DNA）。
3' 端反轉錄引物：15.22-ATTGATGGTGCCTAC。
5' 端 PCR 引物：17.93D-ATCGTAGGCACCTGAAA。
3' 端 PCR 引物：17.92-ATTGATGGTGCCTACAG。
(2) 18 和 24 堿基 RNA Marker 轉錄序列：
T7 啟動子可轉錄 24 個堿基的序列（斜體是 T7 啟動子）。
44.12D：TCACTATTGTTGAGAACGTTGGCCTATAGTGAGTCGTATTACGC，從 44.12D 轉錄來的 RNA Marker（有 AclⅠ酶切位點）。
44.12R：GGCCAACGUUCUCAACAACAAUAGUGA。
從 Dharmacon 購買的 RNA Marker（含有 BamHⅠ酶切位點）。
18.113：AGCGUGUAGGGAUCCAAA。
2. ImpA 的合成
(1) 合成。合成 ImpA 的材料可從 Sigma 公司購買，要求純度至少達到 99%，混合物 A 和混合物 B 用無水的燒杯盛裝，將 A 緩慢地與 B 攪拌混合，開始時兩種混合物不相溶，但當反應顏色轉變為黃綠色的時候，固體物開始溶解，在燒杯底部出現的油狀物最終也會溶解。室溫攪拌 1~1.5 h。
(2) 純化。一滴滴加入沉淀液，ImpA 開始析出，留 60 ml 液體供分析用。把沉淀轉到離心管中，用丙酮洗余下的沉淀，5000 r/min 離心 10 min，倒出丙酮，用丙酮再洗 2 次。最后用乙醚洗，3000 g 離心 20 min，22.5~45℃ 之間真空干燥過夜，然后放在小瓶中 -20℃ 儲存。
(3) 分析。稱量合成物的重量。用 10 倍體積的飽和 (NH4)2SO4 預浸泡纖維素，然后干燥以進行纖維素薄層色譜分析。用水溶解 AMP 和 ImPA。分別將混合物 A、ImpA、混合物 B、純化步驟中的留樣液體、水溶解的 AMP 進行點樣。用 80% 乙醇做展開液，展開 9 cm，AMP 最慢，ImpA 其次，混合物 B 和剩余物在最前端。用手提紫外燈觀察。
3. 寡核苷酸的合成
所有的引物都用 Biosystems 公司的 8900 DNA 合成儀合成。
4. 放射性標記 RNA marker 的制備
體外轉錄 44.12D 獲得 RNA Marker 44.12R。 用 32P 標記 RNA Marker 18.113 和 44.12R，再加 20％ 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，回收獲得放射性標記的 18 和 24 堿基 RNA Marker（操作方法見相關章節）。
5. 寡核苷酸的腺苷酰化作用 1x 的合成
500 μl 反應體系中含 25 mmol MgCl2，50 mmol/L ImpA，0.2 mmol/L 17.91x。50℃ 孵育 3 h，20% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，膠厚度是 1.5 mm，上樣孔為 23 mm 寬。電泳，切膠，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡過夜，再用 2 倍體積的乙醇 -20℃ 沉淀至少一個小時，12000 g 離心 20 min，棄去上清，晾干沉淀，用蒸餾水溶解沉淀。得到的終產物 App 17.91x，可以在 -80°C 條件下保存數月。
6. 微 RNA 提純
15% 變性聚丙烯酰胺膠，樣孔寬 23 mm , 先進行預電泳處理，然后把提取的總 RNA 和痕量的高靈敏放射性標記的 RNA marker（放射性標記的 18.113 和 44.12R）以及 1 倍體積的上樣液混合，80℃ 加熱 5 min，上樣，電泳，直至指示劑染料電泳到電泳槽底部，把膠取下，放射自顯影，將放射標記物之間的部分從膠上切下，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡過夜，再用 2 倍體積的乙醇沉淀，離心后重懸于 10~20 μl DEPC 處理過的水中。
7. 微 RNA 3' 端接頭的連接
3' 端連接反應體系如下：5X RNA 連接緩沖液 2 μl，200 μmol/L App 17.91x 2 μl，T4 RNA 連接酶 1 μl，微 RNA、同位素標記的 RNA Marker 5 μl，總體積 10 μl。
室溫反應 2~6 h 后用 10 μl 2X 上樣液終止反應。用 10% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用放射性標記 Marker，從膠上把 35~43 個堿基之間的部分切下，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡過夜，再用 2 倍體積的乙醇沉淀，最后溶解于 10~20 μl DEPC 處理過的水中。
8. 微 RNA 5' 端接頭的連接
5' 端連接反應體系如下： 5X RNA 連接緩沖液 2 μl，200 μmol/L App 17.93R 2 μl，4 mmol/L ATP 1 μl，T4 RNA 連接酶 1 μl，微RNA 3' 端連接反應產物 5 μl，總體積 10 μl。
室溫反應 2~6 h 后用 10 μl 2X 上樣液終止反應。與 3' 端純化用相同的方法，最終獲得 52~60 個堿基的混合物，重懸于 10~20 μl DEPC 處理過的水中保存。
9. 連接產物微 RNA 的 RT-PCR
反應體系如下：RNA 連接產物 5 μl，100 μmol/L 15.22 3 μl，dH2O 5 μl，
混合后，30°C 加熱 2 min，然后繼續加入：
5X 反轉錄緩沖液 5 μl，10X dNTP 7 μl，100 mmol/L DTT 3 μl，Superscript Ⅱ 反轉錄酶 3 μl。
在加入反轉錄酶之前，先在 48 ℃ 預熱 3 min，從總體積中取出 2 μl 做對照。所有試劑都加完后，在 48℃ 孵育 1 h，然后加入 1 μl 0.1 mol/L EDTA 和 3.8 μl 1 mol/L KOH，90℃ 加熱 10 min，除去所有 RNA，然后用 4 μl 1 mol/L TriS-HCl pH 1.0 和 1 μl 0.2 mol/L MgCl2 中和反應。所有的RT反應產物都用于 PCR 擴增。
PCR 反應體系如下：反轉錄產物 5 μl，10X PCR 緩沖液 10 μl，10X dNTP 10 μl，100 μmol/L 17.92 1 μl，100 μmol/L 17.93D 1 μl，Taq 酶 2 μl，dH2O 71 μl，總體積 100 μl。
94°C 1 min，50°C 1 min，72℃ 1 min，擴增 20~25 個循環。
15% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用 SYBR Gold ( 購于 Molecular Dynamics 公司） 染色。先用苯酚抽提 2 次，再用氯仿抽提 2 次，取水相，加入 NaCl 至 0.3 mol/L，用乙醇沉淀 PCR 擴增產物，最后溶解到 40 μl 中水。
10. PCR 產物的連接
用 BanⅠ消化 PCR 產物，反應用酶及其緩沖液購自于紐英倫生物技術有限公司。反應體系如下：PCR 產物 40 μl，NE 緩沖4 30 μl，BanⅠ20 U/μl 10 μl，dH2O 220 μl，總體積 300 μl。
37°C 反應 4 h。取 15 μl 用 15% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，用 1 μl PCR 產物和 10 bp DNA ladder 做標準對照。用 SYBR Gold 染色。產物用酚和氯仿各抽提 2 次，加入 NaCl 至 0.3 mol/L，再用乙醇沉淀 BanⅠ消化的 PCR 產物。在沉淀中加入下列試劑，進行連接反應：H2O 8 μl，10X T4 DNA 連接酶緩沖液 1 μl，T4 DNA 連接酶 1 μl。
室溫反應 30 min。瓊脂糖電泳，用 100 bp DNA Marker 做標準。從膠上將大于 300 bp 的片段切下來，加 10 倍體積的溶膠液，65°C 放置 5 min，將融化的膠分到多個離心管中，加等體積的酚，振蕩 20 s，冰浴 5 min，于 4℃ 5000 g 離心 10 min，移取水相，用苯酚：氯仿（1：1）混合物再抽提，最后用氯仿抽提。加 0.06 倍體積的 5 mol/L NaCl 和 2.5 倍體積的乙醇，-20℃ 沉淀 2 h 以上。
11. PCR 連接產物與 TOPO 載體的連接
將上步的沉淀溶解在以下的體系中：H2O 11.5 μl，10X PCR 緩沖液 1.5 μl，10X dNTP 1.5 μl，Taq 酶 0.5 μl。
72℃ 反應 5 min。取 5 μl 用于與 TOPO 載體連接。所有的連接產物都用于轉化。在轉化了的感受態菌中加 500 μl SOC 培養基，于 37℃ 培養 45 min，分別用 75 μl、150 μl、300 μl 涂氨芐抗性平板，37°C 生長過夜。
12. 篩選及測序
挑取白色克隆，劃平板，生長過夜，用 PCR 篩選，PCR 反應體系如下：10X PCR 緩沖液 3 μl，10X dNTP 3 μl，100 μmol/L M13F 0.2 μl，100 μmol/L M13R 0.2 μl，Taq 酶 0.5 μl，dH2O 23 μl，總體積 30 μl。
94°C 3 min，94°C 40 s，50°C 40 s，72°C 40 s，進行 25 個循環。瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇包含約為 500~800 bp 插入序列的克隆進行測序。采用生物信息學方法對序列進行分析。
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