熒光定量FAQ專題：前期準備

充分的準備是實驗成功的關鍵，那么，qPCR 實驗需要提前做好哪些了解呢？

試劑的儲存條件

市面上大多數 qPCR 試劑推薦 - 20 ℃ 避光長期儲存。

Vazyme 的 ChamQTM 和 AceQ? 兩個系列的 qPCR Master Mix，長期儲存應置于 - 20 ℃ 避光，解凍后可于 4 ℃ 短暫存放；避免反復凍融。

原始模板稀釋倍數

—是不是拿到一個 cDNA 模板就直接做 qPCR？

—NO!

—是不是拿到一個 cDNA 模板就直接做 qPCR？

—NO!

—是不是對怎么確定稀釋倍數倍感無助？

……

盡量選擇 Ct 值落在 15-28 范圍的稀釋倍數作為原始模板稀釋度。

反應體系與次數

推薦 20 μl 體系，Vazyme ChamQTM/AceQ? QPCR Master Mix 5 ml 可供 20 μl 體系 500 次反應。

伙伴們問：那用 10 μl、25μl、50 μl 體系可以嗎？

小 V 回答：可以，可以，必須可以！

Vazyme ChamQTM/AceQ? QPCR Master Mix 系 2×預混 Mix，推薦體系 20 μl，只要是等比例放大或縮小體系，實驗就能得到保證哦~

模板的上樣量

若直接使用 cDNA 原液作為模板，建議使用體積不超過 qPCR 反應總體積的 1/10！

當復孔之間重復性不佳時，可將模板做適當稀釋后以大體積加入反應體系，可有效提高實驗重復性。看小 V 做的實驗，是不是重復性爆表啊~~~

預變性時間

常見的 qPCR 試劑預變性時間從 30 sec - 15 min 不等。科學家們為了封閉常溫下酶的活性，使 qPCR 產生非特異性擴增的概率降到最低，想出了這種只有在高溫下經過一定的時間才能激活并釋放活性的酶—熱啟動酶。

熱啟動酶多用兩種修飾方式：化學修飾和抗體修飾。

例如：

Vazyme 的 ChamQTM QPCR Master Mix 中的 Champagne TaqTM DNA Polymerase 是經過抗體修飾的 Taq DNA Polymerase，95 ℃ 加熱 30 sec 就可以滅活抗體激發酶活。AceQ? QPCR Master Mix 中 AceTaq?DNA Polymerase 是經過化學修飾的 Taq DNA Polymerase，在溫度低于 80 ℃ 時活性被完全封閉，只有 95 ℃ 加熱至少 5 min 酶的活性才被釋放。有效防止了在樣品準備及反應升溫階段產生非特異擴增和引物二聚體。

ROX 的選取

ROX：一種不受 PCR 反應影響的參比染料，可校正單次反應運行中的信號誤差、移液誤差或蒸發所導致的體積差異，提供更連續一致的重復 Ct 值。

伙伴們好不容易申請到了一份試用裝，然而打開后卻發現有兩管 ROX，到底該怎么選擇呢？

小 V 告訴你：一卡在手，ROX 使用從此不用愁！

趕快拿去對照一下自己的儀器，看看應該用哪一個哦~不同儀器 ROX 的選取參照卡，拿去~

（小 V 再偷偷告訴你：這張卡其實是個冰箱貼哦~）

有了這些干活，伙伴們的準備工作就妥妥的了。