方案2分析之前或之后對磷酸化多肽進行堿性磷酸酶處理

磷酸化多肽樣品在溶液中保存

乙腈堿性磷酸酶甲酸MALDI 基質三氯乙酸

臺式離心機去鹽樹脂MALDI 靶板質譜儀塑料盒加樣吸頭注射器

方法 A: 在 MALDI-MS 分析之前在溶液中去磷酸化的方法

1.根據方案 1 中的附加方案，準備兩個 nanoscale 去鹽柱子（PorosR2 或 PorosR3)。在孵育期間，用 5% 的甲酸保證樹脂濕潤（第 3 步），GELoader? 吸頭的上端作為一個反應室。

2.在每一個反應中，加 20ul 堿性磷酸酶到 50 mmol/L NH4HCO3 中，然后再稀釋 1~2ul 的多肽樣品到堿性磷酸酶溶液中（最后反應溶液的 PH 為 8 左右，必要時用 50 mmol/L NH4HCO3 進行調整，也可以用 pH 試紙檢測）。

要點：準備一個對照反應，GELoader 吸頭中含有 50 mmol/L NH4HCO3, 同時加入與上述等量的多肽，無堿性磷酸酶。

3.GELoader 吸頭于 37°C 孵育 45 min，使多肽去磷酸化。

4.加入 2ul 15% 的甲酸，酸化樣品，通過注射器施壓把樣品加到 Poros 樹脂上。

5.用 20ul 5% 的甲酸洗滌柱子，然后再用 1ul 飽和的 MALDI 基質洗脫柱子，為得到較好的敏感性，把洗脫液按 5?8 小滴加到 MALDI 板上，第 1、2 滴是主要分析的組分。

6.分別記錄從第⑤步中得到的樣品及對照組樣品中的一部分磷酸化多肽的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 線性-TOF 譜圖。

方法 B:MALDI-MS 分析后在溶液中去磷酸化

此法對于 DHB 和 CHCA 兩種 MALDI-MS 基質都適用。

1.根據方案 1 中的附加方案，準備兩個 nanoscale 的去鹽柱子（poros R2 或 Poros R3)。在孵育期間（第④步），用 5% 的甲酸保證樹脂潮濕。

2.用 GELoader 吸頭的上端作為一個反應室。在每一個反應室中加 204 堿性磷酸酶到 50 mmol/L NH4HCO3 中。

要點：準備一個對照反應，GELoader 吸頭中含有 50 mmol/L NH4HCO3。

3.記錄多肽混合物的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 線性-TOF 圖譜。

4.用微量加樣器取0.5~1.5ul 的 70% 乙腈+0.05mol/L NH4HCO3 小心溶解分析物/基質結晶，把等體積的溶解的分析物/基質結晶直接轉移到每一個反應室里。

為成功得到分析圖譜，不銹鋼表面的 MALDI 板必須是「磨光」的或是 AnchorChip0

5.GELoader 吸頭在 37°C 孵育 45 min，使多肽去磷酸化。

6.加人 2 倍體積的 5% 的甲酸，酸化樣品，通過注射器施壓把樣品加到 Poros 樹脂上。

7.用 20W5% 的甲酸洗滌柱子，用 1ul 飽和 MALDI 基質洗脫柱子，為得到最佳的敏感性，把洗脫液按 5~8 小滴加到 MALDI 靶板上，第 1、2 滴是主要分析的組分。

8.記錄堿性磷酸酶處理的多肽的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 線性-TOF 譜圖

方法 c: MALDI-MS 分析后在靶板上去磷酸化

此方法僅適用于 CHCAMALDI-MS 基質。

1.分析分析物/基質結晶中得到 MALDI 反射-T0F 和 MALDI 線性-TOF 譜圖后，用 1.5ul 含有 0.05U/ul 堿性磷酸酶的 0.05mol/L NH4HCO3 溶液在靶板上溶解基質。

2.將靶板放置于一個封閉的塑料盒中，盒中放置濕的織物，以防樣品干燥，37°C 孵育 30 min。

3.用 0.5ul 5% TFA 酸化樣品，這樣是為了使基質再結晶。

4.在 MALDI 分析去磷酸化多肽之前，用 0.1% TFA 輕輕洗滌基質微晶體的表面，以洗掉來自去磷酸化緩沖液中的鹽分和甘油，將 10ul 0.1%TFA 滴到基質上，靜置片刻后迅速用織物的邊緣去除 TFA 溶液。