基 本 方 案 巨 細 胞 病 毒 感 染 小 鼠 模 型材 料B A B L /c 小 鼠（新生或成鼠）或其他品系 純化的鼠巨細胞病毒（m C M V ; 見輔助方案 1 ) 或 唾 液 腺 病 毒（S G V ，見輔助方案2 ) 完全培養基 鋼 網（0 ?45m m ) Ia.感染新生小鼠：用 10?IOOpfu 純 化 的 鼠 C M V 或 S G V 腹腔注射感染新生 BABL/c小鼠，腹部皮下進針，針頭近胸腔部位注射。
新生小鼠感染成功至少要用 IOOpfu 病毒。用 IOOOpfu 病毒感染會引起嚴重的疾病（發育不全、脫毛、生長停止）和高死亡率。 Ib. 感染成鼠：用純化的 I X l O 5Pfu 鼠 C M V 或 S G V 腹腔注射、皮 下（足墊）注射或者靜 脈 注 射（附 件 2E ) 感 染 B A B L /c 成鼠。S G V 具有很高的毒性， B A B L /c 成 鼠 L D 5 0 用量約 lOOOOOpfu。用這個劑量感染小 鼠 會 引 起 嚴 重 的 并 發 性 肝 炎 。 2 . 分別在第 7、 14、 2 1 天 處 死（附 件 3 G ) 感染的小鼠，取 器 官（如唾液 腺 、脾 、肝;附 件 2 H ) 凍存在塑料管中。 一 70°C 保存各個器官直到測定病毒滴度。 3 . 融化器官，用 注 射 器 的 柱 塞（或其他類似無菌器械）反 復 在 0.45m m 鋼網上擠壓器官 ，收集培養皿中的勻漿產物，用 大 約 4m l 的完全培養基沖洗鋼網并收集，總體積約 為 5 ml。 4 . 立即用細胞空斑形成試驗檢測組織勻漿稀釋液中鼠 C M V 滴 度（輔助方案 3)。 脾 、肝 、肺 臟 中 病 毒 滴 度 峰 值 出 現 在 感 染 小 鼠 后 的 第 11? 1 4 天 ， 而 在 唾 液 腺 中增 殖 的 病 毒 滴 度 峰 值 出 現 較 內 臟 器 官 中 的 晚 一 些 。 輔 助 方 案 1 巨細胞病毒的準備材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)小 鼠 胚 胎 成 纖 維 細 胞（M E F ; 見 輔 助 方 案 4 ) 或 其 他 合 適 的 細 胞（例 如 ， NIH3T 3 ， 1 0 % ?3 0 % 匯合生長， A T C C # C R L -1658; B A L B /c 3T 3, A T C C # CCL-163； M 2-10B 4, A T C C # C R L -1972) 完全培養基 小 鼠 巨 細 胞 病 毒（m C M V ): Smith 株（A T C C # V R -194， V R -1399) 或者 K 181細胞株 15 % (W V ) 蔗糖/VSB 165 cm2 組織培養皿 一次性的細胞刮刀 離 心 機（例 如 ， Beckman J2-21，轉子 JA-10， J A - 1 4 ; 或者 Sorvall R C -5，轉子G S 3 ， G S A ) 500m l 和 250m l 無菌離心管 Dounce 勻 漿 器 及 研 磨 棒（Kontes 或 Wheaton) 帶有外旋轉轉頭的超速離心機（Beckman S W 2 8 或其他相似的）及 20m l 的超速離心管 0.45p m 無 菌 過 濾 器（任選） 1 . 在 165 cm2 組織培養皿中用完全培養基培養 M E F 細胞 ，每 隔 2?3d ，按 照 1 : 3 的比例傳三代。培養至細胞面積占據培養皿面積的 7 0 % ?8 0 % (細胞培養 2?3d 后）。 2 . 吸去培養基，加 入 大 約 IO5P f u 經過病毒滴度測定的小鼠 C M V (0. Olpfu/ 個細胞），在 37°C ， 5 % C O 2 孵箱中培養至細胞完全感染病毒（3?5d)。可觀察到培養的細胞變 圓（細胞病變效應， C P E )。 制備未純化的病毒：僅為細胞釋放病毒 3a. 制 備 I m l 和 4m l 含有病毒的上清液保存于一 70°C (可穩定保存一年）。部分用于測定 病 毒 滴 度（見輔助方案 3)。 制備未純化的病毒：細胞釋放的及與細胞內的病毒 3b. 吹 打 細 胞（必要時可用細胞刮刀），收集細胞及上清液。經 過 2?3 次的細胞反復凍融將包含在細胞里的病毒釋放出來。將 部 分 存 儲 ，按 照 步 驟 3a 進行病毒滴度的測定。 未純化的病毒滴度通常大約在 2 X 106pfu/ml。反復的凍融會稍微降低病毒滴度 ，但可使感染的細胞裂解從而釋放細胞中的病毒。這樣獲得的病毒液中由于含有較多的病毒衣殼成分，減少了病毒顆粒的百分含量。 制備純化的病毒：細胞釋放的及與細胞內的病毒 3c. 吹 打 細 胞（必要時可用細胞刮刀），將 細 胞 及 上 清 液 轉 移 入 無 菌 的 500m l 離心管(不用反復凍融）。 4°C ， 6400 g 離 心 20 min，將上清液轉移到 250m l 無菌離心管中。 4c. (可選）：用 5m l 冷的完全培養基重新懸浮細胞，冰 上 勻 漿 2 0 次裂解 細 胞 。 4°C ，22 OOOg 離 心 IOmin 后 ，將上清液轉移進步驟 3c 中的病毒上清液中。 5c. 4°C ， 26 OOOg 離心至少 3 h 收集病毒。棄上清，把帶有少量殘余培養基的沉淀放于冰上， 4°C 過夜。 6c. 用殘留的液體重新懸浮沉淀，冰 上 勻 漿 2 0 次 。把病毒轉移至含 18m l 的 1 5 % 蔗糖/V S B 液 的 20m l 超速離心管中。 4°C ，外旋轉轉頭 72 OOOg 離 心 lh。 7c. 輕輕倒掉上清，加 入 4 ml 1 5 % 蔗糖/ V S B 混勻后，冰上過夜。小 心 的 懸 浮 病 毒（如有需要可再次勻漿）。 8c. 可選：用 0.45/x m 無菌過濾器過濾懸浮液，除去病毒的殼體及聚合物。 9c把過濾的病毒液分裝成 20jul，保存于一 70°C (可穩定的保存一年）。部分用于測定 病 毒 滴 度（見輔助方案 3)。 由于體積的減少，純 化 的 病 毒 滴 度 較 高（1 〇 7?IO9pfu/ml) ，但在純化的過程中，病毒的感染力會降低。反復的凍融也會降低滴度，應盡量避免。 輔 助 方 案 2 唾液腺病毒的制備材 料（其他材料見基本方案，帶 V 項 目 見 附 錄 1)B A L B / c 小 鼠（4?6 周齡） PBS 1 . 給 4?6 周 B A L B / c 小鼠足墊注射 2 X 105Pfu 組織培養來源的病毒。 2.2 周 后 處 死 小 鼠（附 錄 2 G ) ，收集唾液腺，混合集中腮腺、較大的舌下腺和下頜腺。保存腺體于一 70°C (可穩定的保存一年）。 3 . 制 備 組 織 勻 漿（見基本方案步驟 3)，用 P B S 代替完全培養基沖洗鋼網。整個過程冰上操作。 4 . 測定經過唾液腺組織勻漿中的病毒滴度（見 輔 助 方 案 3)，用 5 X 104pfu 經腹腔內感染新小鼠。 5 . 重復步驟 2?4 , 至 少 3 次 以 上（生產更多的病毒）。 6 . 從 第 3 次（或更多次）感染的小鼠體內取腺體，集中每次得到的腺體后進行勻漿 20次。 4°C ， 800 g?離心 5 min。 7 . 將上清液轉移到一個新的管中，用 3?5m l 的 P B S 重新懸浮沉淀物，勻 漿 ，再次離心。將上清液收集到一起，分裝 成 250?500^1 凍存于一 70°C (可穩定的保存一年）。 取一小部分測定病毒滴度（見輔助方案 3)。 輔 助 方 案 3 用空斑形成細胞試驗測定巨細胞病毒滴度材 料小 鼠 胚 胎 成 纖 維 細 胞（M E F ; 見 輔 助 方 案 4 ) 或 其 他 合 適 的 細 胞（例 如 ，N I H 3T 3, A T C C # C R L -1658； B A L B /c 3T 3, A T C C # C C L -163； M 2-10B 4,A T C C # C R L -1972) 試驗樣品： C M V 感染的小鼠器官勻漿（見基本方案），小 鼠 C M V 保 存 液（未純化或純化，見輔助方案 1)，或 唾 液 腺 病 毒（見輔助方案 2)。 完全培養基 黏稠培養基 倒置顯微鏡 4 8 孔組織培養板 平 板 離 心 機（可選） 1 . 滴定的前一天接種 M E F 于 4 8 孔組織培養板中，完全培養基培養。需一定的細胞密度接種，待測定時大約長滿 8 0 % 。 2a. 對組織器官勻漿液病毒：充分勻漿含病毒的器官組織后，加 入 250ul 的勻漿液到4.75m l 的 完 全 培 養 基（1/20)，進行一系列 Iog1。倍數稀釋，從前一個稀釋度中吸取500ul 液 體 與 4.5m l 完全培養基混合，每一步都要混勻。對組織培養產生的病毒或唾液腺病毒，稀 釋 度 0.5 X 10-2?0.5 X 10-8。 2b 對病毒儲存液的稀釋：用完全培養基從 10-3?10-10 進行一系列 Iog1。倍數稀釋。 3.每孔加入 50(^1 的病毒稀釋液，每一個稀釋度至少做三個復孔，為增加測定的敏感度 ， 4 8 孔培養板 800^離 心 30 min (可選）后 ， 37°C ，孵 育 lh。 4 . 移去培養基，用無菌的燒杯或者移液管每孔添加 0.5?1.0m l 黏稠培養基。 37°C ，孵育 4? 5d。 5 . 在倒置顯微鏡下進行病毒斑計數，計算出每毫升病毒所形成的病毒斑數（pfu)。在顯微鏡下，病毒有效感染成纖維細胞后細胞變圓，形成斑點，最后細胞死亡。Ipfu 對應大約 500 病毒。 輔 助 方 案 4 原代小鼠胚胎成纖維細胞的制備材 料孕 鼠（品系不重要）P B S : 無鈣鎂離子 胰蛋白酶溶液： 0.25% (m A O 胰蛋白酶/lmmol/L E D T A 溶 解 于 P B S 中 完全培養基 無菌的外科手術器械：剪刀、解剖刀、鑷子 2?4m m 的無菌玻璃球 無菌紗布或不鎊鋼網（〇 .45m m 的格子大小） 165c m 2 組織培養皿或者 175 cm2 組織培養瓶 1 . 采用脫頸的方法處死懷孕 17? 18d 的 小 鼠（附 錄 2 G ) 。 手術取下小鼠的胚胎，盡可能的取下胚胎的肝和腸。 2 . 無菌操作，避免污染。用剪刀或解剖刀在培養皿中切碎胚囊，用 P B S 沖洗組織碎片，去除紅細胞和細胞碎屑。 3 . 把組織塊轉移到 500m l 無菌的錐形瓶中。每 5?8 個 胚 囊（一層），加 入 30m l 的胰蛋白酶溶液，無菌磁力攪拌，用足夠多的 2?4m m 的無菌玻璃柱覆蓋瓶底。 37°C 慢慢搖 動 30m i n 或室溫放置約 lh。 4 . 加 30m l 的胰蛋白酶和 IOml P B S 到組織塊中， 37°C 攪 拌 30 min。再 重 復 一 次（總共三次加入胰蛋白酶并孵育）。過 量 的 胰 蛋 白 酶 能 降 低 細 胞 的 生 存 能 力 ，相 反 胰 蛋 白 酶 消 化 不 足 會 降 低 細 胞 的得 率 。 5 . 用幾層無菌紗布或 0.45m m 不銹鋼網過濾細胞液（110 ml)。室溫， 250 g 離心細胞懸液 lOmin。棄上清液，用 IOml 的完全培養基重新懸浮沉淀細胞。每 次 攪 動 后 ，在 添 加 胰 蛋 白 酶 到 余 下 的 組 織 碎 片 中 前 ，過 濾 和 離 心（步 驟 5 ) 可以 交 替 進 行 。建 議 超 過 三 次 的 胰 蛋 白 酶 消 化 用 此 方 式 來 提 高 細 胞 的 得 率 。 6 . 用 臺 盼 藍 試 驗（附 錄 3C) 測 定 活 細 胞 的 濃 度 ，并 接 種 I X IO7?2 X IO7 細胞于165 cm2 組織培養皿或者 175 cm2 組織培養瓶中，在 37°C ， 5 % CO2 孵箱中孵育過夜。 7 . 第 1 天 ，除去培養基和細胞碎屑，添加新鮮的培養基，繼續孵育 2d 以上。 8 . 第 3 天 ，當細胞連成一片，凍 細 胞（每一個平皿分成九份）于 液 氮 中（可穩定的保存一年）或者按照 1 : 3 的比例進行傳代。第四代細胞可用于繁殖病毒。 展開 | 