用于人誘導多能干細胞的逆轉錄病毒制備

實驗概要

用于人誘導多能干細胞的逆轉錄病毒制備

主要試劑

0.25%Trypsin、1 mg/mL PDL、Lipo LTX、Opti-MEM、Polybrene、293T培養液

主要設備

35 mm培養皿、4孔培養板，0.45 μm濾器，2mL、5mL、10mL、25mL、15mL、50mL離心管、倒置顯微鏡、生物安全柜、超濾管

實驗材料

293T細胞：293細胞是轉染腺病毒E1A基因的人腎上皮細胞系，293T細胞由293細胞派生，同時表達SV40大T抗原，含有SV40復制起始點與啟動子區的質粒可以復制。
質粒：pMX-Sox2，pMX-Oct4，pMX-Klf4，pMX-c-Myc和pMX-GFP，逆轉錄病毒的gag-pol，VSV-G包裝質粒。質粒擴增和提取的具體原理和步驟可見《分子克隆實驗指南》。

實驗步驟

（1）病毒包裝
！注意：在生物安全柜中進行下述操作。
1）包裝細胞293T復蘇與傳代
①液氮中取出裝有293T細胞的凍存管，迅速放37℃水浴中直到細胞懸液完全融解。
②細胞懸液逐滴加入裝有5 mL預熱的293T培養液的15 mL離心管中，室溫1000 r/min離心5 min，棄上清。
③用細胞基礎培養液培養，一般情況下2～3天傳代一次，傳代比例1:5。
2）轉染質粒到293T細胞
①接種前用1 mg/mL的PDL包被100 mm培養皿，30 min后棄掉PDL，用DPBS清洗后加入293T培養液準備接種293T細胞。
②倒置顯微鏡觀察，當293T細胞90%～95%聚集時，加入0.05%Trypsin消化細胞1～2 min，用細胞基礎培養液終止消化，將細胞懸液轉入15 mL離心管，室溫1000 r/min離心3 min，棄上清。
③按每個100 mm培養皿接種8×10⁶細胞的密度接種。一般每次轉染時，接種5個100 mm培養皿，分別轉染pMXs-Oct4、pMXs-Sox2、pMXs-c-Myc、pMXs-Klf4和pMXs-GFP質粒，其中GFP作為轉染和感染的效率的對照。
④第二天，接種的細胞80%聚集時準備轉染。
⑤棄293T細胞培養液，加入7 mL Opti-MEM培養液。
⑥準備轉染：每個100 mm培養皿需要質粒24 μg（質粒的比例為vsvg:gal-pol:目的基因=3:5:8），用1 mL的Opti-MEM稀釋包裝質粒和目的質粒，同時加入24 μLLipo LTX kit里的Plus，混勻。室溫靜置5 min后加入48 μLLipo LTX。
⑦將第⑥步中的混合液室溫靜置30 min后，逐滴地加入到提前換好Opti-MEM培養液的293T細胞培養皿。
⑧置于培養箱過夜培養。
⑨12h后，吸棄Opti-MEM培養液，加入15 mL新鮮的細胞基礎培養液。
⑩ 24 h后，吸出培養液以收集病毒，并加入15 mL新鮮的含有細胞基礎培養液。48 h后再次吸出培養液以收集病毒。
！注意：所有和病毒接觸過的耗材均要用84消毒液處理。
2.3 3）病毒濃縮
（1）分別把24 h和48 h收集的病毒4℃離心1000 r/min，5 min的離心，收集上清。
（2）用0.45 μm濾器過濾上清。
（3）過濾后的液體分批用超濾管（又叫病毒濃縮柱）過濾。
（4）加15 mL的病毒，4000 r/min，4℃離心20 min，收集病毒濃縮管中間管的濃縮病毒，一般可收獲濃縮病毒200 μL左右，分裝成小包裝-80℃凍存備用。
！注意：超濾管在使用前，加5 mL DPBS后室溫3000 r/min離心10 min.，潤濕后使用。