人外周血染色體制備和體外培養細胞的染色體標本制備

實驗概要

本文介紹了人外周血染色體制備和體外培養細胞染色體標本制備的原理、操作流程及注意事項。

實驗原理

人的外周血淋巴細胞培養方法是1960年由Moorhead 提出來的。正常情況下，人外周血小淋巴細胞都處在G1期（或G0期），但在體外給予一定的條件，進行培養，經72 h就可獲得大量的有絲分裂細胞。這種取材簡易、用血量少的培養方法已被廣泛采用。

在培養液中加入植物血凝素（PHA），淋巴細胞受到刺激可轉化為淋巴母細胞，進入有絲分裂。短期培養后，經秋水仙素處理，可抑制細胞分裂時紡錘絲的形成，使細胞分裂停止在中期，同時它可改變細胞質的黏度，引起染色體在細胞質中分散。經低滲和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色體分裂象。人體的1ml外周血中一般含有約（1～3）×10⁶個小淋巴細胞，足夠染色體標本制備和分析之用。

主要試劑

1. 培養基的配制：

RPMI 1640培養基     4ml

小牛血清            1ml

青霉素和鏈霉素      各100IU/ml

PHA                 0.2ml

肝素                1小滴

以5% NaHCO₃調pH至7.2～7.4, 4℃備用。

2. 肝素：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，滅菌。

3. 秋水仙素：生理鹽水配制成20μg/ml濃度，滅菌，分裝，置－20℃。

4. 低滲液：0.075mol/L KCl。

5. 固定液：甲醇∶冰乙酸（3∶1），臨時配制。

6. Giemsa工作液：1份原液和９份磷酸緩沖液，臨時配制。

7. 磷酸緩沖液：1/15mol/L Na₂HPO₄、1/15mol/L KH₂PO₄等體積混合。

8. 5% NaHCO₃滅菌濾器抽濾備用。

主要設備

1. 2ml注射器、培養瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20min。

2. 離心管、吸管、量筒、載玻片，經洗液按常規清洗、烘干備用。

3. 超凈工作臺，恒溫培養箱，天平，離心機、顯微鏡等。

實驗材料

人外周血

實驗步驟

1. 人外周血染色體制備

   1) 接種，培養

      a.在無菌條件下，用滅菌注射器吸取0.2%肝素液（生理鹽水配制，滅菌）0.2ml，濕潤針筒后，采靜脈血1～2ml、轉動注射器使血液與肝素充分混勻。

      b.無菌條件下，將肝素化血液滴入至外周血培養基內，每5ml培養液內滴入血滴28～30滴（7號針頭）輕輕混勻。

      c.置37℃恒溫箱內，靜止培養68～72h。注意第二天觀察培養液有無凝血、溶血或長菌的現象，可每天將培養液搖一搖以便細胞得到充分培養。

      d.終止培養前2～3h，加入濃度為20μg/ml的秋水仙素，每5ml培養基中用7號針頭，加3～4滴使最終濃度為0.1μg/ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內，繼續培養2～3h，以積累較多停止在中期的分裂象。

   2) 制片

      a.收獲細胞：由恒溫箱取出培養瓶，用吸管充分吹打培養瓶瓶壁，使細胞全部脫離瓶壁，然后將細胞液移至錐形離心管內，1500轉/min，離心10min，去上清液。

      b.低滲處理：加入37℃預溫的0.075mol/L KCl 8ml，反復吹打（約一百次）后，置37℃水浴箱中低滲處理25min左右。

      c.預固定：加入新鮮制備固定液1ml（甲醇∶冰醋酸=3∶1），輕輕混勻。

      d.離心：2000轉/min，離心10min，吸棄上清液。

      e.固定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混勻，固定10min。

      f.離心：同上，吸去上清液。

      g.再固定：加固定液8ml，混勻，固定10min。

      h.離心：同上，吸去上清液。

      i.制細胞懸液：根據細胞量多少，加入適量固定液，充分混勻，制成細胞懸液。

      j.滴片：取出預先經冰水浸泡的載玻片，用吸管吸取混勻的細胞懸液在離冰片約750px距離進行滴片，每片約滴2～3滴細胞懸液，使細胞較好分散。一般每一培養瓶可制3～5張標本片。

      k. 染色：標本晾干后，即可用染液（Giemsa液原液1份，pH6.8的磷酸緩沖液9份）染色15min，自來水沖洗后（從背面沖洗）晾干。

   3) 鏡檢：人類每個體細胞有46條染色體，根據染色體的長度和著絲粒位置的不同，可以分成22對常染色體和一對性染色體，男子是46，XY；女子是46，XX。

2. 體外培養細胞的染色體標本制備

   1) 體外培養的細胞，在倒置鏡下觀察到有較多的分裂細胞（傳代后24h，圓形發亮的細胞）時，加入秋水仙素溶液，終濃度為0.3μg/ml培養液；

   2) 繼續培養3h；

   3) 胰酶消化收集細胞至離心管；

   4) 離心1000轉/min，離心10min，去上清；

   5) Hanks液洗，離心，去上清；

   6) 低滲處理：加入0.075mol/L KCl溶液8ml，置37℃恒溫水浴中30min，用吸管稍吹打（同上）；

   7) 固定及制片如外周血染色體的制備。

注意事項

1. 秋水仙素處理時間過長，分裂細胞多，染色體短小；反之，則少而細長,故秋水仙素的濃度及時間要準確掌握。

2. 固定液應在使用前臨時配制。

3. 載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。

4. 染色體分裂指數低：患者處于非常時期（放、化療期）；培養基營養成分不良；培養基pH偏低或偏高；PHA過量或不足；小牛血清質量不高；培養箱溫度偏低；秋水仙素處理時間過短。

5. 接種的血樣愈新鮮愈好。

6. 培養過程中，如發現血樣凝集，可將培養瓶輕輕振蕩，使凝塊散開，繼續放回37℃恒溫箱內培養。