轉移因子的制備及檢測實驗

實驗概要

本實驗采用透析法制備了轉移因子(TF)，并進行了檢測。

實驗原理

TF是一種可溶性不耐熱的小分子多核苷酸肽，分子量約3 500～5 000。56℃30min可滅活，低溫保存數年活性不消失。由于轉移因子能將供體某種特定的細胞免疫功能，特異地傳遞給受體，即具有傳遞特異性細胞免疫的作用，所以稱為轉移因子。另外它還能非特異地增強一般細胞免疫作用。轉移因子的作用發生迅速，給受體注射后數小時即出現皮試陽性反應。維持時間也較長，可達數月至一年以上。轉移因子具有免疫特異性，能特異地轉移供體的遲發型超敏反應，這種免疫轉移無種屬特異性，能在種間交叉轉移。由于轉移因子是小分子成分，無抗原性，長期應用，機體也不產生抗體。在實際工作中多采用動物的脾、淋巴結或外周血白細胞制備轉移因子。

主要設備

高速組織搗碎機、低溫冰柜、離心機、透析袋、紫外分光光度計及E玫瑰花環試驗所用器材等。

實驗步驟

1. 制備勻漿：將凍存的豬(人)脾臟或淋巴結取出融化，摘除脂肪及結締組織，充分洗凈。用絞肉機絞碎，加適量生理鹽水后，用高速組織搗碎機高速勻漿2次，每次1min。將勻漿置-20℃凍結。

2. 透析含量測定及凍干：將上述勻漿取出融化，以3 000r/min離心30min，取上清，將上清置透析袋內，用無熱原的冷生理鹽水在0～4℃環境下透析過夜，袋外透析液即為制備的轉移因子。取袋外透析液測核糖含量及吸收度，按測定結果進行分裝并凍干。

3. 檢定

1) 鑒別

a. 取本品1支，加水溶解，按分光光度法測定，在251±1nm處有最大吸收度；260nm與280nm波長處吸收度比值應≥20；

b. 取本品1支，加水溶解。取2ml加入適量茚三酮溶液，加熱后應呈紫色。

2) 酸堿度

取本品10支，加水溶解，在酸度計上精密測定pH值，應為6.0～8.0。

3) 蛋白質

取本品1支，加水溶解，加入磺基水楊酸試液適量，混勻不得出現混濁。

4) 水分

按碘硫溶液法測定，不得超過3%。

5) 安全試驗

取本品適量，加水溶解，小鼠尾靜脈注射適量，48h內不得有死亡。

6) 熱原

取本品1支，加水溶解依法檢查，應符合規定。

7) 菌檢

取本品3支，用無菌鹽水溶解，分別接種到檢查需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養基上，37℃培養1周，應無菌生長。

8) 核糖

以標準D核糖為標準品，取本品3支分別測定，每支含核糖均不得低于60μg。

9) 吸收度

取本品5支，加水溶解，用分光光度法進行測定，其吸收值應為0.55左右。

10) 超敏反應

取健康無傷豚鼠6只，每只腹腔注射本品適量，連續3次，于20日后再自耳靜脈注入本品適量，應無超敏反應現象發生。

11) 乙肝抗原及抗體測定

取本品1支，加水溶解，以放免法測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBcAg、HBcAb，應為陰性。

12) 活性

采用E玫瑰花環試驗，對照管中加入淋巴細胞及綿羊紅細胞，試驗管中加入淋巴細胞、綿羊紅細胞及適量本品。試驗管E玫瑰花環率應較對照管高20%以上。

注意事項

1. 所用臟器應新鮮，勻漿時應徹底搗碎。

2. 各步所用蒸餾水均無熱原。

3. 轉移因子常溫下易喪失活性，因此，有關操作(如透析)應在低溫下進行。常溫下的各種操作均應快捷迅速。