文庫甘油儲存料中噬菌體抗體的制備

實驗概要

本實驗從文庫甘油儲存料中制備了噬菌體抗體。

主要試劑

1. 2×TY/amp/glu培養基

2. TYE/amp/glu平板

3. 含有25ug/ml卡那霉素和2％葡萄糖的TYE平板(TYE/kan/glu)

4. 含100ug/ml氨芐青霉素和25ug/ml卡那霉素的2×TY培養基(2×TY/amp/kan)

5. 輔助噬菌體(VCSMl3、R408或M13K 07 Stratagene、NEB或Amersham Biosciences)

6. 20％聚乙二醇(PEG)6000，2.5mol/L NaCl溶液

7. 磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH 7.4

主要設備

1. 500ml無菌聚丙烯離心瓶

2. 2L培養錐形瓶

3. RC5離心機和GS3轉頭(Sorvall)

實驗材料

文庫甘油儲存料

實驗步驟

1．取適當數量的甘油文庫儲存料接種到含有250m1 2×TY/amp/glu的 2L培養錐形瓶中。培養基的A₆₀₀值應小于0.05。從每個培養瓶中取1ul鋪板確定起始接種物的細菌量。

2．在37℃下振蕩(300r/min)培養，直到A₆₀₀值為0.05(1.5～2.5h)。

3．按照輔助噬菌體與細菌之比等于(10～20)：1的比例加入輔助噬菌體。孵育培養液，37℃30分鐘，需水浴中直立放置并不時攪拌；而后，37℃振蕩培養30分鐘。

4．從每瓶中取lul并用1ml 2×TY稀釋；取1ul及10ul分別在TYE/amp/glu和TYE/ kan/glu平板上鋪板，以確定輔助噬菌體感染有效性。每個平板上的克隆數應當大致相同，同時卡那霉素抗性克隆數應大于氨芐青霉素抗性克隆數的10％。

5．將500ml瓶裝入GS3轉頭，以3000r/min離心細菌培養液。棄去上清。

6．將細菌沉淀重懸于2×TY/amp/kan中，并分裝到2L錐形瓶中；其中的培養液不應超過250ml。在25～30℃下振蕩(300r/min)培養過夜。

7．用GS3轉頭及500ml瓶以10000r/min 30分鐘離心菌液。將上清部分轉移至1個新的500ml瓶內。

8．將l/10～1/5體積的PEG溶液加入到上清中，冰上放置1小時。這會使噬菌體沉淀，此時上清中會呈現云霧狀。

9．用GS3轉頭及500m1瓶以4000r/min，4℃15分鐘離心沉淀噬菌體。棄去上清。再離心“干”沉淀30秒，以甩掉最后幾滴上清。去除液體。用1/10體積的PBS重懸沉淀。

10．以10000r/minl5分鐘離心沉淀細菌碎片，并將上清轉移至1個新瓶中。

11．重復步驟7-9以進一步純化噬菌體，但最終重懸液的體積應當是起始培養液體積的1/50。這樣制備的噬菌體可以立即用于選擇，否則需按每份10¹³個噬菌體等量分裝，保存于-80℃。