斑點免疫金銀染色檢測牛結核血清抗體

實驗概要

本實驗應用斑點免疫金銀染色(Dot－IGSS)檢測了牛結核血清抗體。

主要試劑

1．抗原牛結核PPD。

2．血清待檢血清、標準結核陽性血清和結核陰性血清。

3．硝酸纖維膜孔徑0.45μm。

4．氯化金(優質)

5．0.2Mol/L PB液

6．0.05Mol/L Tris—HCl緩沖液

7．硝酸銀顯影液(現用現配)：

   明膠(20g/L) 6.00ml

   對苯二酚(57.90g/L) 3.00ml

   硝酸銀(25g/L) 0.20ml

    pH3.5檸檬酸鹽緩沖液 1.00ml

   對苯二酚和硝酸銀溶液需避光保存，臨用前將明膠加熱溶解后，按上述比例依次混合。

8. pH3.5檸檬酸鹽緩沖液的配制：

   檸檬酸(C₆H₈O₇·H₂O) 25.50g

   檸檬酸三鈉(C₆H₅Na₃·2H₂O) 3.50g

   去離子水加至 100.00ml

   溶解后即可使用。

9. 定影液

   硫代硫酸鈉(Na₂S₂O₃) 20.0g

   去離子水加至 100.00ml

   溶解即可。

10. 兔抗牛IgG抗體。

實驗步驟

1. 膠體金的制備試驗用水均要求三蒸餾水并過去離子柱，最終去離子水的電阻大于100萬Ω。所有容器最終均用去離子水清洗。

   1) 采用鞣酸-枸櫞酸鈉還原法制備

   A液 1％HAuCl₄ 2.00ml

   去離子水 158.00ml

   B液 1％枸櫞酸鈉 8.00ml

   0.1％Mol/L K₂CO₃ 0.20ml

   1％鞣酸 0.20ml

   去離子水 31.60ml

將A液和B液分別于60℃水浴30min，并不時攪拌，迅速將B液加入至A液中，攪拌，顏色為深藍色，繼續加熱至100℃，5 min～10min，溶液顏色變為深紅色，自然冷卻后4℃保存。

   2) 膠體金鑒定：外觀呈深紅色、晶瑩透亮，迎著日光可見有光帶。電鏡觀察膠體金粒子大小平均為10nm，顆粒大小一致，分布均勻。

2. 膠體金與兔抗牛IgG用量比例的確定每ml膠體金所需的最低穩定蛋白量是30μg，根據試劑用量增加20％，所以每ml膠體金所需的最低穩定兔抗牛IgG量為36μg。

3. 金標記兔抗牛IgG的制備取所需量的兔抗牛IgG，加入少許去離子水，用0.1Mol/L K₂CO₃溶液調pH值為9.0(用精密pH試紙測定)，同時膠體金溶液的pH值也調至9.0。在磁力攪拌下，將20ml膠體金溶液加入至兔抗牛IgG中，繼續攪拌10min，加入3.5ml 3％的聚乙二醇(分子量20 000)作為穩定劑，以使其最終濃度達到0.05％，再攪拌15min后，置4℃冰箱保存備用。

4. 金標兔抗牛IgG的純化將金標記的兔抗牛IgG以2 500r/min離心15min，以除去膠體金的聚合物，取上清以65 000g離心1h，可見離心物分為三層，上層為淡黃色，含有未結合的兔抗牛IgG，下層為近黑色，是尚未結合的膠體金顆粒,最主要的中間層為紅色，是結合良好的金標記的兔抗牛IgG，傾去上層，收集中層液，用含0.1％BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原體積的1／10，過濾除菌，分裝，4℃保存備用。

5. 金標記兔抗牛IgG的鑒定

   1) 顆粒大小及均勻度鑒定：取少許金標記的兔抗牛IgG，負染，電鏡觀察顆粒大小及均勻度，并測量粒子直徑大小。

   2) 活性鑒定：將牛IgG點樣于硝酸纖維膜上，直接加金標兔抗牛IgG抗體，應顯示出明顯的粉紅色斑點。

6. 正式試驗程序

   1) 點樣以打孔器將微孔濾膜制成直徑3mm的膜片。將牛結核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀釋為40μg/ml，用微量加樣器加1μl抗原于膜片中央，37℃烘干10min。

   2) 封閉將膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2％BSA的PBST液中，37℃作用45min，其間振蕩數次。取出后以蒸餾水洗滌1次，用濾紙吸干。

   3) 加待檢血清待檢血清以PBST液做1:160倍稀釋。將膜片浸入其中，37℃作用1h，其間振蕩數次。取出后，以PBST液洗滌后，濾紙吸干。此步同時設標準陽性血清和陰性血清對照。

   4) 加金標抗體以PBST液將金標液作1:10稀釋，將膜片浸入其中，37℃作用2h，中間振蕩數次。

   5) 銀染將膜片從金標液中取出，于去離子水洗滌3次，每次3min。然后將膜片浸入暗室中的銀染色液中，室溫下作用10min，移入定影液中，室溫作用5min。然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結果。