基因工程菌－海洋線蟲系統的生物測定

實驗概要

本實驗在成功構建了表達Cip蛋白的重組釀酒酵母的基礎上，對其應用于Panagrellus redivivus線蟲的生物測定進行了探討，并與重組大腸桿菌比對。

主要試劑

1. 主要試劑

   1) 蛋白胨（Peptone)，廣州環凱微生物科技有限公司；

   2) 尿嘧啶（Uracil)，AMRESCO進口分裝，上海生工；

   3) 膽固醇（Cholesterol)，AMRESCO進口分裝，上海生工；

其他試劑為國產分析純。

2. 培養基和常用溶液

   1) NGM（Nematode Growth Medium)培養基

NaCl                          3 g

Peptone                        2.5 g

H₂O                           to 1 L

如配制固體培養基，還需加入1.7％瓊脂粉。高壓滅菌50 min后，待培養基冷卻至55℃，依次加入下列試劑：

CaCl₂（1 mol/L)                1 mL

Uracil（2 mg/mL)               1 mL

Cholesterol（10 mg/mL)          0.5 mL

磷酸鉀緩沖液（1 mol/L，pH 6.0) 25 mL

MgSO₄（1 mol/L)               1 mL

小心混勻后，倒平板，注意不要引入氣泡，NGM平板可在4℃保存數周。配制液體NGM則待完全冷卻后，依次加入上述試劑。

   2) M9緩沖液

Na₂HPO₄                       6 g

KH₂PO₄                        3 g

NaCl                           5 g

MgSO₄·7H₂O                   0.25 g

以雙蒸水定容至1000 mL，高壓滅菌50 min，室溫保存。

   3) 0.1％硫柳汞，稱取0.1 g硫柳汞溶于100 mL雙蒸水中，細菌過濾器過濾除菌，4℃保存。

   4) 1 mol/L CaCl₂溶液，稱取無水CaCl₂ 11.1 g，溶于100 mL雙蒸水中，高壓滅菌20 min，保存于4℃。

   5) 2 mg/mL尿嘧啶（Uracil)，準確稱取尿嘧啶100 mg溶于50 mL雙蒸水中，細菌過濾器過濾除菌，4℃保存。

   6) 10 mg/mL膽固醇（Cholesterol)，確稱取膽固醇0.5 g溶于50 mL無水乙醇中，4℃保存。

   7) 1 mol/L磷酸鉀緩沖液（1 mol/L K₂HPO₄，1 mol/L KH₂PO₄，pH 6.0)，分別配制2 mol/L K₂HPO₄及2 mol/L KH₂PO₄溶液，準確量取12.3 mL K₂HPO₄溶液與87.7 mL KH₂PO₄溶液，與80 mL雙蒸水充分混勻，測定溶液的pH值，如有必要微調至6.0，以水定容至200 mL，高壓滅菌20 min，4℃保存。

   8) 1 mol/L MgSO₄溶液，稱取MgSO₄·7H₂O 24.647 g，溶于80 mL雙蒸水，定容至100 mL，高壓滅菌20 min，保存于4℃。

主要設備

1. 24孔及96孔細胞培養板，美國Corning公司；

2. XSZ-D2型倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠；

3. Leitz020-435.025光學顯微鏡，德國ERNST LEITZ WETZLAR GMBH；

4. 40倍雙目解剖鏡，日本Nikon；

5. 細菌過濾器（0.2 μm孔徑)，美國Pall公司。

實驗材料

1. 大腸桿菌Escherichia coli OP50；

2. 釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1；

3. 重組釀酒酵母INVSc1/pYES2.1/V5-His-TOPO-cipA、INVSc1/pYES2.1/V5-His-TOPO-cipB；

4. 海洋線蟲Panagrellus redivivus。

實驗步驟

1. 菌株的培養

   1)  大腸桿菌的培養

在LB（50 μg/mL Car)培養基中培養基因工程菌BL21（DE3)/pET-15b-cipA、BL21（DE3)/pET-15b-cipB、BL21（DE3)/pET-15b至對數生長期，將菌液均分為兩份，一份中加入IPTG溶液（終濃度為1 mmol/L)，另一份不加，37℃繼續培養8~12 h。

   2)  釀酒酵母的培養

對攜帶有cipA或cipB基因的重組釀酒酵母，挑取直徑2 mm左右的單菌落，挑取SC-U（2％葡萄糖)平板上重組酵母單菌落，接種于15 mL SC-U（2％葡萄糖)中，250 r/min、30℃培養過夜；測定菌液OD₆₀₀值，分別吸取2 mL菌液，離心（1500 g，4℃，5 min)，將細胞沉淀以無菌SC-U（2％半乳糖)培養基洗滌一次，分別重懸于10 mL無菌SC-U（2％半乳糖)和10 mL無菌SC-U（2％葡萄糖)中，250 r/min、30℃分別培養18 h、12 h；

對釀酒酵母INVSc1，于YPD液體培養基中培養12 h即可。

2. 線蟲的制備

   1) 線蟲的培養

      A. 按照2％的接種量，接種E. coli OP50 100 μL于5 mL LB培養基中，37℃，200 r/min振蕩培養24 h；

      B. 吸取培養OP50菌液0.1 mL，滴加至NGM平板上，無菌刮棒平鋪后，37℃倒置培養24 h；

      C.  將線蟲種接入培養有OP50菌株的NGM平板上，置于25℃。

   2) 無菌J1線蟲的獲得

      A. 查看NGM平板上雌蟲的形成情況和懷卵情況，一般培養42 h后大部分雌蟲都有發育成熟的卵；

      B. 超凈工作臺上，收集懷卵雌蟲，用無菌針頭將懷卵雌蟲挑至裝有無菌M9緩沖液的培養皿中；

      C. 以無菌M9緩沖液清洗收集的線蟲三次：吸取M9緩沖液到培養皿中，混合均勻，使線蟲懸浮并與液體充分接觸，待線蟲自然沉降后，用移液器將緩沖液吸走；

      D.  加入0.1％硫柳汞，使懷卵雌蟲充分懸浮，置于25℃，50～70 r/min體表消毒半小時；

      E.  挑10條左右上述處理后的懷卵雌蟲，置于培養皿中，加入200 μL無菌M9緩沖液；

      F. 解剖鏡下，用無菌針頭將蟲體刺破，待卵自然漂浮離體后，將蟲體移開；

      G. 選取漂浮的單顆分離的卵，用無菌200 μL吸頭吸至加有無菌M9緩沖液的24孔細胞培養板上，每孔100～150顆卵；

      H. 以無菌M9緩沖液清洗收集的卵2次，清洗后，待卵自然沉降，解剖鏡下吸走液體，小心不要吸走卵；

      I. 加入400 μL無菌NGM液體培養基，置于25℃，50～70 r/min緩搖過夜，觀察是否有細菌生長，以及卵的恢復情況；

      J. 2～3天后，如果沒有雜菌生長，由卵所孵化出的J1幼蟲即可視為無菌幼蟲，可以用于后續的實驗操作。

3. 重組大腸桿菌－海洋線蟲培養系統的建立

以無菌Panagrellus redivivus J1幼蟲為目標線蟲，按照以下方法建立液體測定系統：

   1)  生物測定前，測定各待測菌液的OD₆₀₀值，如有必要，以無菌LB（50 μg/mL Car)液體稀釋各菌液至相等的OD₆₀₀值，待用；

   2) 在24孔細胞培養板上，分別加入各待測菌液（包括誘導和未誘導的)，每孔250 μL，以無菌LB(50 μg/mL Car)為空白對照，每個處理設三個重復；

   3) 每孔中加入15條J1線蟲，以parafilm膜封口；

   4) 25℃下，將培養板置于水平搖床上緩搖培養（70 r/min)，每24 h檢查線蟲生長、繁殖及死亡情況。

4. 重組釀酒酵母—海洋線蟲培養系統的建立

以無菌Panagrellus redivivus J1幼蟲為目標線蟲，按照以下方法建立液體測定系統：

   1) 對各培養菌液，離心獲得細胞沉淀，以無菌NGM洗滌沉淀一次，然后重懸于無菌NGM液體中。以無菌NGM培養基為空白對照，調整細胞懸浮液的OD₆₀₀值，使之均為2.5；

   2)  在24孔細胞培養板上，分別加入培養的酵母細胞懸液（包括誘導和未誘導的)及對照懸浮液，每孔250 μL，以無菌NGM液體為空白對照，每個處理設三個重復；

   3)  每孔中加入10～15條J1線蟲，以parafilm膜封口；

   4) 25℃下，將培養板置于水平搖床上緩搖培養（70 r/min)，每24 h檢查線蟲生長、繁殖及死亡情況。

5. 鏡檢與數據分析

倒置顯微鏡及體視鏡下，檢查幼蟲生長發育情況、雌雄蟲形成、雌蟲懷卵量、繁殖情況、各種蟲態的死亡情況以及第二代線蟲的形成情況。

數據以百分數形式表示，經平方根反正弦轉化后，以SPSS 11.5 軟件進行統計分析。本文中，除明確說明外，生物測定的平均數據以“平均數±標準誤（SE)”表示，方差分析采用鄧肯氏新復差檢驗法（Duncan’s Multiple Ranger Test，DMRT)。