抗癌藥物引起血液系統毒性作用觀察

實驗概要

掌握抗癌藥物的主要毒性作用特點及作用靶點，學習外周血液細胞計數、骨髓涂片及觀察方法。

實驗原理

目前臨床應用的多數抗癌藥物是通過抑制腫瘤細胞的生長而產生活性，尤其是細胞毒類抗癌藥物，這些抗癌藥物對腫瘤組織和正常組織的選擇性較差，在抑制腫瘤細胞生長的同時，將對正常組織產生很強的毒副作用。主要包括對造血系統細胞增殖的抑制作用；對胃腸道及其他消化系統的毒性作用；對免疫系統功能的抑制作用等。其中對細胞分裂及生長迅速的骨髓造血系統等具有極敏感的抑制作用，首先表現在骨髓血小板系統、粒細胞系統、淋巴系統等受到抑制，并最終紅細胞的生成受到抑制。檢查進入外周血循環各系細胞數量，反應對骨髓造血系統的毒性作用，作為適時檢測用藥的依據。

主要試劑

環磷酰胺，甲醇（固定細胞用）

主要設備

離心機，離心管，血細胞計數板，取血管，骨髓涂片用玻璃片, 吹風機。

實驗材料

動物：昆明種小鼠

實驗步驟

1.   給藥：將小鼠隨機分為A和B兩組，每組10只，A組腹腔注射環磷酰胺60mg/kg,B組腹腔注射生理鹽水0.5ml,連續3天。

2.   計數外周血細胞：取小鼠，尾靜脈或眼內呲取血20 μl置于1980ul白細胞稀釋液內(稀釋100倍)，以玻璃棒或加樣器取少許置血細胞計數板內，分別計數白細胞、紅細胞和血小板數量，并與正常對照動物比較。

3.     骨髓懸液的制備、涂片、染色：處死動物，取股骨去凈組織后，以1ml的注射器，抽取1-2ml血清或生理鹽水，沖洗至離心管內。離心2000-3000rpm/m，3-5分鐘，棄上清，將沉淀置玻璃片并涂片，快速干燥，甲醇固定，瑞士染色后，光學顯微鏡下觀察并計數各系統細胞相對比例。

注意事項

1.   尾靜脈或內吸取血量必須準確。

2.   骨髓涂片后要快速干燥，以防細胞形態皺縮。

[附錄]

1.紅細胞計數（red-cell counting）

1.1.材料

血紅蛋白吸管、試管、血細胞計數盤及蓋片、玻棒

1.2.紅細胞稀釋液配制

1.2.1.赫姆稀釋液

氯化鈉                            1g

硫酸鈉(Na₂SO₄·10H₂O)               5g

 (或無水硫酸鈉 Na₂SO₄               2.5g )

氯化高汞                          0.5g

蒸餾水加至                        200ml

過濾備用。

若血液中血漿球蛋白增高，使用該稀釋液易發生紅細胞凝集，可改用下列稀釋液：

1.2.2.

氯化鈉                          0.6g

枸櫞酸鈉                        1.0g

36％中性甲醛                    1.0ml

蒸餾水加至                      100ml

過濾備用。

1.3.方法

1.3.1.取樣    在試管內加入紅細胞稀釋液1980ul，然后用吸管準確吸取20μl血液，擦凈吸管外沾染的血液，將吸管插入試管底部，輕輕吹出血液，并用上清液吸洗吸管2～3次，將試管輕輕搖動1～2min，使血液與稀釋液充分混勻。用潔凈玻棒蘸取少量已混勻的紅細胞懸液，一次滴入計數盤內，使之灌滿，靜置2～3min后計數。

1.3.2.計數  先在低倍鏡下掃視計數盤內紅細胞分布是否均勻，然后把計數盤中央的大方格置于視野中。并將鏡頭換成高倍，計數5個中方格（共80個小方格）內紅細胞數。壓在線上的紅細胞，只計數一個中方格四條線中的兩條線。最后把所得總數×10 000，即為1mm³（ml）血液中的紅細胞總數。

2.白細胞計數（leukocyte counting）

2.1.材料

血紅蛋白吸管、小試管（0.6×20px）、血細胞計數盤及蓋片、玻棒

2.2.白細胞稀釋液

冰醋酸                          2.0ml

1％龍膽紫                       1.0ml

蒸餾水加至                      100ml

 其中龍膽紫僅為顯色用，以區別其他稀釋液。

2.3.方法

2.3.1.取樣    在試管內加入白細胞稀釋液0.38ml，然后用吸管準確吸取20μl血液，擦凈吸管外沾染的血液，將吸管插入試管底部，輕輕吹出血液，并用上清液吸洗吸管2～3次，將試管輕輕搖動1～2min，使血液與稀釋液充分混勻。用潔凈玻棒蘸取少量已混勻的紅細胞懸液，一次滴入計數盤內，使之灌滿，靜置2～3min后計數。

2.3.2.計數  在低倍鏡下計數內四角的四個大方格中所有白細胞數，最后把所得總數×50，即為每mm³（ml）血液中的白細胞總數。

3.血小板計數（platelet counting）

3.1.材料

血紅蛋白吸管、小試管（0.6×20px）、血細胞計數盤及蓋片、玻棒

3.2.血小板稀釋液

3.2.1尿素稀釋液

尿素                         10g

枸櫞酸鈉                     0.5g

40%甲醛                      0.1ml

蒸餾水加至                   100ml

 過濾后4℃保存備用。

3.2.2.草酸銨稀釋液

草酸銨                       1.0g

蒸餾水加至                   100ml

過濾后4℃保存備用。

3.3.方法

3.3.1.取樣    在試管內加入血小板稀釋液0.38ml，然后用吸管準確吸取20μl血液，擦凈吸管外沾染的血液，將吸管插入試管底部，輕輕吹出血液，并用上清液吸洗吸管2～3次，將試管輕輕搖動1～2min，使血液與稀釋液充分混勻。靜置3～5min，待紅細胞溶解后再搖勻。用潔凈玻棒蘸取少量已混勻的紅細胞懸液，一次滴入計數盤內，將計數盤置于濕潤的平皿內，15min后計數。

3.3.2.計數  計數方法同紅細胞，總數×10000，即為每mm³（ml）血液中血小板總數。

細胞形態

紅細胞：圓盤形，兩面略凹，無核。

白細胞：圓形，有核。

血小板：橢圓、圓形或不規則形，大小約為紅細胞的1/5~1/3，無核。

4.注意事項

4.1.所用器皿要干凈。

4.2.血液與稀釋液應充分混勻。

4.3.計數室內細胞分布要均勻。

4.4.細胞懸液滴入計數室內時，液量要適當，過多或過少都會影響計數結果。

4.5.血小板計數時，搖動試管要輕，以減少血小板破壞，推薦使用草酸銨稀釋液。

骨髓涂片染色及方法

用瑞氏吉姆薩（Wright-Giemsa）混合染色法

1. Wright-Giemsa混合染色液配制

Wright染液                 5ml

Giemsa原液                 1ml

雙蒸水                     6ml

2.染色步驟

涂片干燥后滴加Wright-Giemsa混合染色液，染5～10min后，自來水快速沖洗，晾干，鏡檢。