實驗概要
通過本實驗學習和掌握堿裂解法提取質粒。
實驗原理
堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互纏繞，仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH 至中性時，共價閉合環狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那木迅速而準確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質－SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
主要試劑
1． 溶液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖
5 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH 8.0)
10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0）
[0.5 M EDTA：93.05g EDTA.Na2，8g NaOH，充分溶解后調pH值至8.0] （滅菌）。
[1M Tris-HCl（1000 mL）：121.1g Tris，49 mL濃HCl，充分溶解后調pH值至8.0]（滅菌）
2． 溶液 Ⅱ
0.4 mol/L NaOH， 2% SDS，用前等體積混合（新鮮配制）
3． 溶液 Ⅲ
5 mol/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4. TE 緩沖液
10 mmol/L Tris.HCl
1 mmol/L EDTA(pH 8.0)
5. 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）
6. RNase
將RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg／ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于－20℃。
7. LB Amp100培養基：LB液體培養基內加入100ug/mL的氨芐青霉素。注意Amp遇高溫分解，待培養基溫度低于60℃時加入。
主要設備
恒溫搖床、冷凍離心機、移液槍一套、制冰機、三角瓶、Eppendorf管、試管、培養皿、試劑瓶、超凈工作臺。
實驗步驟
（一）細菌的培養
將含有pUC19質粒的大腸桿菌，在LB Amp100培養基平皿上劃線，獲得單菌落。（37℃培養過夜）
（二）質粒提取
1. 將2 mL含Amp（100ug/mL）的LB液體培養基加入試管中，接入上述的含pUC19質粒的大腸桿菌（單菌落），37℃振蕩培養過夜。
2. 取培養物倒入1.5 mL微量離心管中，4000 r/min 離心2 min。
3. 倒出培養液，使細胞沉淀盡可能干燥。
4. 將細菌沉淀懸浮于100 uL溶液Ⅰ中，充分振蕩混勻，室溫放置5 min。
5. 加200 uL溶液 Ⅱ（新鮮配制），蓋緊管口，顛倒混勻內容物，將離心管放冰上5 min 。
6. 加入150 uL溶液 Ⅲ（冰上預冷），蓋緊管口，顛倒數次使混勻。冰上放置5 min 。
7. 12000 r/min ，離心15 min ，將上清轉至另一離心管中。
8. 向上清中加入等體積氯仿/異戊醇（24:1）（去蛋白），反復混勻，10000 r/min，離心10 min，將上清轉移到另一離心管中。
9. 向上清加入2倍體積乙醇，混勻后，室溫放置15～20min。12000r/min離心10 min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
10. 用500 μL 70% 乙醇洗滌質粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。
11. 加入適量（30 μL）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。