堿性磷酸酶的染色檢測

實驗概要

了解堿性磷酸酶的染色檢測方法。

實驗原理

本試驗是一個酶組織化學試驗，酶組織化學是在不破壞組織細胞的條件下，檢測酶的存在，定位與活性的學科，即在酶的存在，分布及其用在顯微鏡下變成可見的。生命是有序的，包括時間的有序及其空間的有序。其中美的空間有序性在于其細胞組織結構的精確位置，各種酶的自己的位置保證了化學活動的有效進行。
酶的定位方法必須準確，其顯示方法必須具有高度的特異性，使酶本身具有可見性，這是一種直接的方法，目前主要有免疫熒光化學法，該法敏感性高，速度快，但成本高。如果有相同的抗原決定簇時，則會有交叉反應。方法成熟，使用廣泛的還是經典的組織化學方法。下面以堿性磷酸酶的顯示方法來學習經典酶組織化學的理論及操作。經典酶組織化學不是顯示酶本身，常采用的方法是：在一定條件下，使細胞中的酶作用于酶的底物，使其產物在原地進行捕捉、沉淀轉化為有色產物。堿性磷酸酶（AKP）的顯示方法最早由Gomeri（1939）提出，現在這種方法稱為Gomeri法。堿性磷酸酶是指磷酸單酯酶Ⅰ，它能在pH8.6~10.0的最適條件下分解磷酸單酯，對于與磷酸相接的醇基沒有特異性，Gomeri法是讓該酶在堿性條件下，分解甘油磷酸鈉，產生磷酸根。

在孵育液中加入CaCl₂，分解產生的磷酸根離子立即被Ca² 原位捕捉形成沉淀。

    HPO^2-- Ca² →→CaHPO₄  ↓（無色沉淀）

因出現的是無色沉淀，故還不能在光鏡下觀察到，尚需轉化為有色沉淀，先讓制片與Co（NO₃）₂反應生成磷酸鈷：

    CaHPO₄ Co（NO₃）₂ →→CoHPO₄ ↓（無色沉淀） Ca（NO₃）₂

 再讓它與硫化銨反應生成黑色的硫化鈷沉淀。

    CoHPO₄ （NH₄）2S→→（NH₄）₂HPO₄ CoS  ↓（黑色沉淀）
我們可以在顯微鏡下觀察到黑色沉淀的位置，由于以上的這些操作都是在原位進行的，可以認為黑色沉淀的位置就是酶所在的位置，這類方法是讓酶作用于底物而將酶顯示出來。因此制作酶組織切片的時候不能使酶失活，還要盡量避免酶所需的反應的產物擴散，否則不會得到正確的結果。

主要試劑

1. 二甲苯                                  
2. 無水乙醇

3. 95%乙醇                                
4. 90%乙醇

5. 70%乙醇                                
6. 30%乙醇

7. 3% 甘油磷酸鈉                          
8. 2%巴比妥液

9. 2% 氯化鈣                              
10. 2%硫酸鎂

11. 2%硫化銨（45ml蒸餾水 硫化銨6-7滴）  
12. 2%硝酸鈷

13. AKP作用液：

          3%甘油磷酸鈉                 10ml

          2%巴比妥液                    10ml

          2%氯化鈣                        2 ml

          2%硫酸鎂                        1 ml

            蒸餾水                         20 ml

主要設備

1. 立式染缸                                       12個                     

2. 鑷子                                              2把

3. 量筒               25ml                        1個

                        10ml                        1個

4. 恒溫水浴（37°C）                           1個

5. 沸水浴                                           1個

6. 電爐                                              1個

實驗材料

組織制備
1. 取材：取動物腎、小腸等大塊組織，大小約2-3mm
2. 固定：將取下的材料迅速在冷丙酮中固定24小時（一直在4°C中進行），中間換冷丙酮4次
3. 包埋：將固定好的材料，用純酒精脫水30分鐘（中間交換一次），二甲苯透明（20分鐘），用快速法把材料包埋于石蠟中（用低熔點的石蠟）
4. 切片：切片5~6μ，在37°C以下的溫水中展片，將蠟片粘于涂有蛋白膠的載波片上
5. 把切片置于37°C溫箱種干燥小時
6. 將切片置于4°C的冰箱，直至試驗前才取出

實驗步驟

1. 每人取已粘好烘干的鼠腎切片兩塊，放入二甲苯（一）→→二甲苯（二）（各3-4分鐘）的染缸中進行脫蠟，再經100%乙醇（一）→→100%乙醇（二）→→95%乙醇→→90%乙醇→→70%乙醇→→30%乙醇→→水。每級各一分鐘，在移切片時，用鑷子夾住切片震蕩并提起，放下反復幾次，在移入下一染缸邊緣前稍停留，讓溶液滴凈后，再入下一染缸，以免把上一染缸溶液過多帶入下一染缸，而影響切片質量；

2. 將其中一塊切片以蠟筆作一標記（用作對照組切片），放入沸水中煮沸5分鐘；
3. 將兩塊切片均放入AKP作用液中孵育30-60分鐘，作用液要事先預熱到37°C，水浴中進行；

4. 取出切片在蒸餾水中洗滌；

5. 放入硝酸鈷溶液2-3分鐘；

6. 蒸餾水沖洗干凈，否則切片易被污染，影響定位；

7. 切片浸入硫化銨中2-3分鐘；

8. 蒸餾水沖洗干凈；

9. 經各級酒精脫水。即30%乙醇→→70%乙醇→→90%乙醇→→950%乙醇→→100%乙醇（二）→→100%乙醇（一），各級一分鐘。

注意事項

觀察結果：

在顯微鏡下觀察，細胞中有黑色沉淀存在的地方，就表明有酶的存在。煮沸的對照切片無黑色沉淀。