（二）乳過氧化物酶法（LPO）
本法反應溫和，對抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應用。缺點是標記率較低，一般為20～40%。
1．原理此法是利用乳過氧化物酶（Lactoperoxidase）有促進微量過氧化氫對125I-的氧化作用，生成125I+，并標記在多肽、蛋白質酪氨酸分子上。
2．方法以標記蛋白質抗原為例。
（1）反應液組成：蛋白質2～5μg溶于磷酸緩沖液10～25μl中，加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳過氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl)；
（2）在室溫保溫7min；
（3）加入H2O2200ng(10μl)；
（4）過7min再加入H2O2(3μl)；
（5）保溫7min后，加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應；
（6）10min后加入NaI載體溶液1ml ；
（7）按常規方法分離純化。
3．注意事項
（1）LPO質量好壞，可直接影響標記率，LPO應在使用前新鮮配制，以防酶活性降低。
（2）LPO用量應小于總蛋白質用量的1%，以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質。
（3）碘化反應速率分析表明，酶的催化速度很快。
（4）碘化反應在pH4.0～8.5較寬范圍內均可進行，最適pH值應依據蛋白質本身性質而定。
（5）H2O2應保持低濃度，如高于0.1mmol/L，對酶的活性將有抑制作用。
（三）Iodogen碘化法
此法具有標記率高、反應體積小（3ml水平）、可用低濃度的125I原料、對多肽激素和蛋白質的免疫活性損失小、穩定等優點，系常規的碘化方法之一。
1．原理 用Iodogen為氧化劑，對蛋白質和多肽抗原進行碘化標記，把125I直接引進分子中的酪氨酸殘基上。標記過程中被標記樣品不與Iodogen混合，標記后取出樣品即停止反應，不使用任何還原劑。
2．方法
（1）標記之前，先把Iodogen溶于有機溶劑，涂于管底，并使之干燥。
（2）標記時，將蛋白質溶液10～20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反應管中，反應管置于冰浴中。碘化時，125I與蛋白質克分子之比例為1～1.2。反應時間在溫和的連續的攪拌下可達10min，從反應管中轉移出反應混合液，使其反應停止。反應液轉移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，層析分離前再放置5min，使其未標記的碘離子還原成分子碘，以避免在帶有緩沖液的柱中使白蛋白碘化。
3．注意事項
（1）涂有Iodogen的反應管，有氮氣中密封，并貯存在-20℃條件下，至少可用3個月。打開管，使用時間很短。
（2）碘化反應時間，7min時標記率達最高，10min時略有減少。PH6.0～8.5時，標記率最高。
（3）Iodogen與蛋白質的比率是標記率的函數。最大的標記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比。
（四）酰化試劑（Bolton和Hunter試劑）法
1．原理這個方法用酰化劑3--（4-羥苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter試劑）做連接試劑，將125I標記在羥苯基的2，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過一個酰氨鍵將3--（4—羥基—5—125I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。
2．方法125I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行制備，出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時取一定量的標記酯（μmol 蛋白用3～5μmol標記酯），用氮氣吹除苯，投入欲標記蛋白5～10μg及緩沖液10～50μl,pH8.0～8.5為宜，在冰浴中反應15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使過量標記酯消耗掉以終止反應。
此法避免了蛋白質與氧化劑的接觸，又避免了與放射性碘原子的直接接觸，可防止碘源中有害物質對蛋白質的損傷，適用于標記缺乏酪氨酸的蛋白質或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后會引起蛋白質的失活。其缺點是標記技術比較復雜，需要接觸較多的放射性，經二步反應，碘標記率比較低。一般認為此法不宜標記短肽，而適于分子量大于1萬的蛋白質。
三、放射性標記化合物的純化與鑒定
（一）純化標記化合物的常用方法
不論使用何種制備方法，要獲得合格的標記化合物，都必須將反應物經過仔細的分離、純化。另外，一些標記化合物，經過一定時間的存放后，往往會出現不純物，而需再純化。如碘標記生長激素（125--HGH）,在剛標記的第2天，從Sephadex G-100過濾譜上可見，幾乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1個月后，峰II組份減少，峰I和峰III成分明顯增加，峰I是集聚的標記生長激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化學雜質（圖8--3）。
圖8－3 125I—HGH的Sephadex G-100過濾譜
實線：新鮮制備的 125I—HGH 虛線：保存1個月的125I—HGH
標記化合物的純化方法，除制備比活度低而化學量又較多的標記物可用重結晶、蒸餾、萃取等常規方法外，一般需用微量分離技術，較方便的是層析法、離子交換法、凝膠過濾及高效液相層析法等。現以碘標記蛋白為例，說明以上各種方法的適用情況。
1．凝膠過濾法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分離標記蛋白與無機碘時，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100進一步純化。
2．離子交換法一般是制成離子交換層析柱，用于分離純化短肽標記物。
3．透析法 能將標記蛋白與小分子化合物很好地分離。
4．電泳法可用來分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質。
5．親和層析法利用蛋白質與其特異抗體或受體的結合來分離、純化標記蛋白質。此法特異性強，保持生物活性好，但操作較復雜。
6．高效液相層析法此法最大優點是分離效果好、快速，但需特殊設備。
7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一種植物凝集素，對糖蛋白有良好吸附能力，因此適于分離標記糖蛋白。吸附的標記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。
（二）標記化合物的主要質量指標
作為示蹤劑及分析試劑的標記化合物，應具有比一般非標記化合物更高的質量要求。標記化合物的質量指標包括：放射性核純度、放射化學純度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及標記位置和定量分布情況等。
1．放射性核純度及其檢查方法
（1）放射性核純芳可用下式表示：
放射性核純度（%）=所需放射性核素的活度/樣品的總放射性活度×100
（2）放射性核純度的檢查方法：每一種核素都有它的特征，即物理半衰期及射線能量，故可通過半衰期及射線能量的測定來鑒別所需放射性核的純度。
①測定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用時間跟蹤法，每隔一定時間測量放射性一次，共測3～5個半衰期，以每次測得的放射性計數為縱座標，時間為橫座標，在半對數紙上作圖，并通過分析，可求出該放射性核素的純度。
②測定射線能量法：利用每一放射性核素的特征射線譜來檢查放射性核純度。γ發射體可用γ能譜儀，如檢測57Co和58Co的核純度：純β-發射體可用液閃儀，調節 道寬及淬火校正后，對如3H、14C、32P的核純度進行測量；而β、γ混雜垓素，則用吸收法測量，如99mrTc中母體雜質99mMo的含量測量，是通過適當厚度的鉛屏蔽，將99mTc 發射的能量為141ke V的γ射線減弱后，測定99Mo發射的能量為739Kev 的γ射線。
2．放射化學純度及放化純度鑒定
（1）放射化學純度：放射性核素標記化合物都是以一定的化學形態存在的，所以：
放射化學純度（%）特定化學形態的放射性活度/樣品總放射性活度×100
放射化學純度受制備方法及原料的化學純度、產物存放條件等影響，一般放化純度控制在95%以上。
（2）放射化學純度的測定方法：原則是高效的化學分離與靈敏的放射性測量相結合。常用下列方法：
①放射層析法，又稱放射色譜法：本法是利用色譜技術使混合物中各組份分離，然后測定各組份的放射性活度。它具有選擇性高、分離效果好、操作簡便等優點，在放化純度鑒定中是一種重要的分析方法。最常用的是放射性紙層析法和放射性薄層層析法。
②放射性高效液相層析法：它對分離純化標記化合物及鑒定標記化合物的放化純度都有很大潛力，具有分析速度快、分離效率高、適用范圍廣等特點（幾乎80%的有機化合物均可應用）。關鍵是要選擇合適的固定相和流動相，使產品與雜質分離。在流動相中，被分析物各組份的濃度變化可用紫外或熒光檢測器檢測，而其放射性活度，可同時由放射性探測儀測定。放射性活度測定最簡單的一種辦法，是將洗脫液分部收集，然后在γ儀或液閃儀上進行測量；另一種較理想的是連續測量，在洗脫液流通池外包圍一個固體閃爍探頭，進行γ計數或在流通池前加一個三通混合室，用另一個泵混入閃爍液，測定軟β射線。可以與紫外控測器的掃描圖，同步描繪出放射性的分布圖。
③放射性核素反稀釋法：取一定量（W1）已測定比活度（SO）的標記化合物（約0.1～10mg），用>1000倍化學量（W2）的純載體稀釋，充分混勻后反復純化到比活度恒定不變（Sp），此標記化合物的放化純度值應為：
有時該值>100%時，往往是由于所用載體化學純度不夠。因本法操作要求嚴格，一般不作常規放化純度鑒定用。
3．化學純度及化學量的測定標記化合物中的非放射性化學雜質雖一般不會對示蹤結果帶來直接干擾，然而這種雜質的含量越多對標記化合物在使用、存放過程中分解、變性的影響就越大。此外，也已發現某些標記化合物的化學雜質會給使用帶來直接影響。如用氚標記類固醇作放射免疫分析試劑，其中的化學雜質會影響標記抗原與抗體的結合率，使分析靈敏度降低。因此，對標記化合物的化學雜質含量，同樣必須加以控制。
要制得化學純度的標記化合物，最好是對可能產生的雜質加以防止。這要在冷試驗中解決。因為冷試驗所得產品是非放射性的，其化學純度可用常規方法，如溶點、沸點測定，NMR、紅外、紫外譜分析等手段加以鑒定，得到合格產品后，再按同樣方法及條件進行標記制備。
對于標記化合物的化學含量，則必需在標記反應及一定純化步驟后進行，由于需要高比活度的標記化合物，往往樣品的放射性很強，而化學量極微（如某氘標記化合物，分子量為300，每分子上標記2個氘原子，氘的同位素活度為99.8%，則理論上每25mCi（925MBq）的化學量還不足（130μg）,所以需用微量分析法才能測定其含量。一般而言，各種常規微量分析技術均可應用。目前大多用紫外分光、熒光光度等進行含量測定。
4．放射性比活度及其測定
（1）放射性比活度簡稱比活度，過去也稱比放射性。
比活度＝放射性活度／單位化學量
（2）比活度的理論值計算：每種放射性核素有一個比活度理論值，取決于該核素的半衰期和衰變常數。若N是1毫克原子（1mA）的總原子數，衰變常數λ（單位時間衰變的%），則
任何元素每1mA的原子數都相同，等于阿伏加德羅常數，即6.023×1020個，故
若T1/2min為單位，則上式的活度單位為dpm/mA,進行單位換算后為：
根據上式，可計算出每種放射性核素比活度的理論值（常用放射性核素的比活度理論值見表8-2）。如果標記化合物每分子接上一個放射性核素原子，則以上原論值亦為該標記化合物的比活度（每毫摩爾的活度）理論值。
表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值
（亦即每分子一接一個該放射性核素原子的標記化合物的經活度理論值）
| 放射性核素 | 半衰期 | 比活度理論值（每mA或mmol的活度） |
14C | 5730年 | 0.0624 Ci (2.3 GBq) |
3H | 12.33年 | 29.0 Ci(1073 GBq) |
45Ca | 165天 | 793 Ci (29.3 TBq) |
75Se | 118.5天 | 1100 Ci(40.7 TBq) |
35S | 87.4天 | 1494 Ci (55.2 TBq) |
125I | 60.2天 | 2196 Ci(80.3 TBq) |
131I | 8.04天 | 16240 Ci (600 TBq) |
(3)放射性比活度測定方法
