蛋白質檢測－WesternBlot

蛋白質檢測－Western Blot

1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。

1）轉移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。

2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。

3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。

4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。

5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉移。

6）轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。

2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現時取出，記錄下標準位置。

3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。

4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。

5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。

6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。

7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。

8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下搖動2小時（或4℃過夜）

9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。

10．  將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內，于室溫下搖動1小時。

11．  按步驟9洗滌。

12．  加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下搖動1小時。

13．  按步驟9洗滌。

14．  配制顯色指示劑/底物：混合顯色指示劑原液3.0ml，PBS 9.0ml，加入1%過氧化氫150.0微升。立即使用。

15．  于室溫下搖動直至出現紫色并開始看到背景（1~10分鐘）。

16．  將薄膜轉到另一盛水容器中洗滌，終止顯色反應，空氣干燥，封入塑料袋中避光保存。