DNA（基因）檢測－SouthernBlot

DNA（基因）檢測－Southern Blot

DNA吸印轉移

1．室溫下將電泳后的瓊脂糖凝膠浸入500ml溶液A中，搖動30分鐘后換500ml新鮮溶液A再搖30分鐘，使DNA雙鏈堿變性。

溶液A：

5M NaCl     300.0ml

10M NaOH    50.0ml

H₂O         650.0ml

2．為使凝膠重新回到中性，換入溶液B中重復上述1過程。

溶液B：

10M 乙酸銨      200.0ml

10M NaOH         4.0ml

H₂O            1796.1ml

硝酸纖維素薄膜（NC膜）

3．料盒或盤中放一玻璃板支架，倒入10×SSC，將Whatman 3MM濾紙放在玻璃板上，兩頭浸在液體中，用玻棒趕除氣泡。

4．心地將瓊脂糖凝膠翻過（扣過來）滑到紙上，放平、趕除氣泡。

5．將預先浸于溶液B中的NC膜，平鋪在膠上，用玻棒趕除氣泡。

6．在膜上放置兩層預先以10×SSC浸濕的Whatman 3MM濾紙。

7．再放6張干燥吸水紙及4堆75px厚的折疊吸水紙。

8．在紙上覆蓋玻璃平板，板上可置約250g重物，下部緩沖液根據虹吸原理能被吸上來，凝膠上的單鏈DNA即可被吸出并轉移到NC膜上。轉移速度取決于DNA片段的大小。<1kb的片段在0.7％的膠中2小時即可轉出，而15kb的片段需15小時以上，一般維持12～24小時。

9．轉移完成后，將膠與膜取出，通過樣品槽、表明記號，并剪去膜的一角，以識別方向，此時膜與膠正面觀察的方向是一致的。

10．  去掉膠，令膜稍加干燥，用圓珠筆標號。

11．  如為硝酸纖維素膜，則用3MM濾膜包好，80℃烘烤2小時。若為尼龍膜則用紫外等照10分鐘，使DNA牢固地結合于膜上，即可用于分子雜交。

12．  將膜在6×SSC中浸泡幾分鐘，放入塑料袋，按0.2ml/cm²膜面積加入預雜交液，排凈氣泡封閉袋口，在68℃水浴中振動預雜交2～4小時。

13．  取出塑料袋，在一角切一缺口，倒出預雜交液，按50μl/cm²膜面積加入雜交液，排凈氣泡、封口，再于68℃水浴中振動雜交，一般來源于真核細胞的總DNA，需雜交12～16小時。

14．  雜交結束后取出塑料袋，剪開邊緣，迅速將膜轉到2×SSC和0.5％EDTA溶液中室溫下洗滌（振蕩）5分鐘，再將膜轉移人2×SSC和0.1％SDS溶液中洗滌15min，然后將膜浸入0.1倍SSC和0.5％SDS溶液中68℃振蕩洗滌2小時，換同樣溶液再洗滌30分鐘。

15．  取出濾膜在Whatman濾紙上晾干，放入塑料袋或用塑料紙包好，在暗室中將X光片與濾膜接觸，封于曝光夾中，進行放射自顯影1～15天。

16．  X光片被取出。常規顯定影后顯示雜交情況，如曝光時間不夠可重新放入X光片再次曝光，直到帶型顯示清晰。