消除膽紅素對肌酐測定的負干擾方法比較

測定血清肌酐（簡稱 cRT）的 jaffe氏法已經沿用了100多年，至今仍然被廣泛地應用，然而對肌酐的顯色并不特異。血清中能與堿性苦味酸反應的物質還有蛋白質、葡萄糖、抗壞血酸、丙酮、α-酮酸等。這些“假肌酐”物質通常對肌酐測定產生正干擾。由于它們的反應速度比肌酐慢，因此利用速率法在20～100s間進行測定[1]可以使肌酐的反應占絕對優勢，提高反應的特異性。盡管如此，仍舊不能克服膽紅素對測定的負干擾。如何消除這一干擾，近年來國內外有人報道利用酶法和某些全自動生化分析儀的特殊功能 rate-Blank或 rate-B法能夠從方法學角度排除干擾，并取得了良好的效果。本文就這一問題進行回顧和評價，并對各方法進行比較。

　　1膽紅素對肌酐測定產生負干擾的原理

　　堿性苦味酸速率法測定的原理是肌酐同堿性苦味酸反應形成了一種紅色復合物，通常在510nm外根據測定時間（20～80s）內血清和標準液吸光度的增加量計算肌酐的含量。而膽紅素在510nm處也有較強光吸收，并且在氫氧化鈉的作用下，逐漸轉化為620nm處有強光吸收的膽綠素，而膽綠素在520nm處只有很弱的光吸收，這樣就掩蓋了肌酐本身的顯色反應的表現，從而使測定結果偏低，甚至出現負值。有實驗證明[1]，氫氧化鈉對膽紅素的作用與肌酐存在與否無關；肌酐含量越低，本身的顯色反應弱，相對干擾就嚴重。血清中的游離、結合膽紅素對肌酐的動力學測定都有干擾作用。

　　2預處理法

　　預處理法主要是利用各種氧化物，使膽紅素被氧化成膽綠素后再測定血清肌酐含量。加入的氧化物主要有以下幾種：

　　2.1高鐵氰化鉀 OLeary和 pembroke等人[2]設置試劑1（ r1）：高鐵氰化鉀2mmol/L，試劑2（ r2）：氫氧化鈉200mmol/L，若味酸25mmol/L，臨用前按5：1配制。標本： r1： r2=20μ l：20μ l：400μ l。主波長505nm，副波長570nm。樣品與 r1混合后5min再加入 r2，延滯時間60s，讀數時間60s。試驗證明600μ mol/L以內的膽紅素對肌酐測定無影響。汪俊軍等人[3]推薦含有十二烷基硫酸鈉、硼酸、氫氧化鈉、苦味酸、高鐵氰化鉀濃度分別為24、10、200、15.5、0.20mmol/L的試劑配方為臨床實驗室自動化分析測定肌酐的試劑配方，樣本與試劑體積比為3：29，其它參數：波長520nm，溫度37℃，測定時間30s，延遲時間20s。汪氏認為當高鐵氰化鉀濃度達到0.20mmol/L時，轉變1000μ mol/L的膽紅素可以在前20s內基本完成。可以看出用高鐵氰化鉀可以較好地消除膽紅素對肌酐測定的干擾，但范仲元等人[4]提出加入的高鐵氰化鉀的量對測定結果有一定影響。試劑中加入高鐵氰化鉀后，標準液的反應速率有下降趨勢。血清標本反應速率在加入高鐵氰化鉀濃度較低時有下降，但下降比率遠較標準液為小，而加入濃度較高時反應速率有明顯升高，總的效果是加入高鐵氰化鉀后使肌酐測定結果升高，且隨高鐵氰化鉀濃度的升高而升高。

　　2.2過氧化氫――過氧化物酶葉耀征等人[5]取黃疸病人血清200μ l，加入1.76mol/L過氧化氫5μ l混合，再加800KU/L過氧化物酶5μ l，充分混合后置37℃水浴15min。3000rpm離心3min后再與堿性苦味酸試劑反應測定血清肌酐。試驗證明200μ mol/L以內的膽紅素對肌酐測定無影響。可以看出，由于在消除膽紅素過程中需要一定的水浴時間和溫度，此法比較繁瑣，不利于全自動生化分析儀操作。為了克服以上缺點， rajs等人[6]將該法進行改良，認為由于間接膽紅素與白蛋白為非共價結合，所以過氧化氫對直接膽紅素的氧化過程快于對間接膽紅素的氧化，為了提高氧化效率，縮短氧化時間，將咖啡因――苯甲酸鹽加入過氧化氫――過氧化物酶中，使間接膽紅素從蛋白質中置換出來，37℃反應7min（多數情況下，3～5min已經足夠）后，再加入堿性苦味酸試劑測定血清肌酐。用該法在 cobas mira全自動生化分析儀上證明435μ mol/L以內的膽紅素對測定無影響。盡管如此，由于過氧化氫與過氧化物酶、氫氧化鈉與苦味酸需臨用前配制且不宜久置，所以操作上仍比較繁瑣。

　　2.3膽紅素氧化酶 lorene等人[7]利用膽紅素氧化酶在肌酐測定前預處理血清樣品取得了良好效果。其中膽紅素氧化酶1000U/L。室溫孵育15min。國內陳偉英等人[8]利用膽紅素氧化酶在 cobas fARA-Ⅱ型全自動生化分析儀上也取得了類似的效果，將樣品8μ l與膽紅素氧化酶（200U/ml）8μ l混合，以膽紅素氧化酶氧化樣品中的膽紅素，再加入若味酸試劑80μ l作為起動試劑，進行肌酐測定，其中保溫時間90s，反應時間100s。但由于膽紅素氧化酶不易獲得且成本較昂貴，因此該法在國內未得到普及。

3采用酶法測定肌酐

　　piero fossati等[9]和張厚亮等[10]利用該法測定血清肌酐，其中試劑1： n-哌嗪-N′-2-乙烷磺酸（ hEPES）-NaOH緩沖液、肌酸脒基水解酶（ cRTase）、尿素酶、谷氨酸脫氫酶（ gLD）、異檸檬酸脫氫酶（ iCD）、α-酮戊二酸。試劑2： hEPES-NaOH緩沖液、 cRNase、反式 n， n， n’， n’-四乙酸-1，2-二氨基環乙烷（ cYDTA）。其反應原理略。

　　酶法測定肌酐具有操作簡便、特異性好、靈敏度高、不受膽紅素及多種藥物影響、適用于全自動或半自動生化分析儀，不僅能測定血清，而且也可以測定尿液，是目前認為測定肌酐最好的方法，但是其價格相當昂貴，一般至少是堿性苦味酸法的10倍以上，就國內醫療水平，難以普及。

　　4采用 rate-Blank或 rate-B法測定肌酐

　　rate-Blank法是利用全自動或半自動生化分析儀中的特殊功能（樣品速率空白）來達到克服膽紅素干擾的目的。所謂樣品速率空白是指將樣品與試劑1（氫氧化鈉）混合后作為樣品空白測得的反應速率，也就是樣品中膽紅素被氫氧化鈉氧化吸光度下降的反應速率，儀器經過自動扣除這種反應速率，將膽紅素的負干擾值自動補償入肌酐與堿性苦味酸的反應中，從而達到了消除干擾的目的。 hoffman rJ、 gerhard g及 alecey v Moshkin等人[11~13]利用 rate-Blank法在 hitachi737、736、 cobas mIRA上取得了良好效果。 n.O’Leary等人[1]將高鐵氰化鉀法與 rate-Blank法相比較發現兩法有很好的一致性。

　　rate-B法（ twin test）是利用同一反應杯在一個反應周期內進行兩個試驗測定的功能。如果這兩個試驗均為速率法時，第一個反應的速率可以自動補償入第二個反應的速率中去。我們把血清肌酐測定過程分解為兩個試驗，第一個試驗測定膽紅素在堿性環境下被氧化引起吸光度減少的速率，第二個試驗測定加苦味酸后，肌酐與苦味酸反應所引起吸光度增高以及膽紅素被氧化所引起的吸光度減少的總的速率。即前者測定膽紅素的干擾，通過儀器微機自動處理，后者在結果計算中自動清除這種干擾，從而利用 rATE-B法達到清除膽紅素對肌酐測定干擾的目的。 osselaer、 lievens及石凌波、林龍順等人[14，15]利用該法在 hitachi717、704、747、7150分析儀上取得良好效果。

　　rate-Blank或 rate-B法從方法學角度克服了黃疸對肌酐測定的干擾，試劑中不加任何附屬成分，操作簡便，與酶法結果一致，但此法在應用過程中受到了儀器的局限性。