微生物學檢驗基本技術(1)

隨著現代醫學及相關科學技術的發展，各學科相互交叉和滲透，醫學微生物學檢驗技術已深入到細胞、分子和基因水平，許多新技術、新方法已在臨床微生物實驗室得到廣泛應用。醫學微生物學實驗室的基本任務之一是利用微生物學檢驗技術，準確、快速檢驗和鑒定臨床標本中的微生物，并對引起感染的微生物進行耐藥性監測，為臨床對感染性疾病診斷、治療、流行病學調查及研究等提供科學依據。

第一節　微生物形態學檢查

　　細菌形態學檢查是細菌檢驗的重要方法之一，它是細菌分類和鑒定的基礎，可根據其形態、結構和染色反應性等，為進一步鑒定提供參考依據。
一、顯微鏡檢查
　　由于細菌個體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。一般形態和結構可用光學顯微鏡觀察，其內部的超微結構則需用電子顯微鏡才能看清楚。常用顯微鏡有如下幾種。

1．普通光學顯微鏡
　　采用自然光或燈光為光源，其波長約為0.4μm。顯微鏡的分辨率為波長的二分之一，即0.2μm，而肉眼可見的最小形象為0.2mm。故用油（浸）鏡放大1 000倍，能將0.2μm的微粒放大成肉眼可見的0.2mm。普通光學顯微鏡可用于細菌、放線菌和真菌等的觀察。

2．暗視野顯微鏡
　　常用于觀察不染色微生物形態和運動。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從中間直接透入，視野呈暗色，當標本接受從聚光器邊緣斜射光后可發生散射，因此可在暗視野背景下觀察到光亮的微生物如細菌或螺旋體等。

3．相差顯微鏡
　　相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉換為光強度差。在相差顯微鏡下，當光線透過不染色標本時，由于標本不同部位的密度不一致而引起光相的差異，可觀察到微生物形態、內部結構和運動方式等。

4．熒光顯微鏡
　　熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡基本相同，主要區別在于光源、濾光片和聚光器。目前大多數使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發出紫外光或藍紫光。濾光片有激發濾光片和吸收濾光片二種。用藍光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強熒光與背景的對比。本法適用于對熒光色素染色或與熒光抗體結合的細菌的檢測或鑒定。

5．電子顯微鏡
　　用電子流作為光源，波長與可見光相比差幾萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學放大系統，放大倍數可達數萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細菌超微結構的觀察。

二、不染色標本檢查
　　不染色標本一般可用于觀察細菌形態、動力及運動情況。細菌未染色時無色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周圍環境的不同來進行觀察。有鞭毛的細菌運動活潑，無鞭毛的細菌則呈不規則布朗運動。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形態和運動方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法等。

1．懸滴法
　　在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環取一環菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的凹孔對準蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下（或暗視野）觀察。

2．壓滴法
　　用接種環取一環菌懸液置于潔凈玻片的中央，在菌懸液上輕輕蓋上一蓋玻片，注意避免產生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數秒鐘后置高倍鏡下明視野（或暗視野）觀察。

3．毛細管法
　　主要用于厭養菌動力的檢查。通常選用60~70mm長。0.5~1.0mm孔徑的毛細管虹吸厭養菌懸液后，用火焰將毛細管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野觀察。

三、染色標本檢查
　　細菌標本經染色后，由于細菌與周圍環境間在顏色上形成鮮明對比，故在普通光學顯微鏡下可清楚地觀察到細菌的形態特征（如細菌的大小、形狀、排列等）和某些特殊結構（如莢膜、鞭毛、芽孢等），并可根據染色反應性對細菌加以分類鑒定。

（一）細菌染色的一般程序
　　細菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脫色）—（復染）。

1．涂片制備
　　血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養物，直接在載玻片上作薄膜涂片；尸檢或感染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環取一環生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環取少量的培養物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠火慢慢烘干。

2．固定
　　目的是殺死細菌，凝固細菌蛋白及結構，便于染色；促使細菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉；改變細菌對染料的通透性，有利于菌細胞內結構的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3．染色
　　根據檢驗目的不同，選擇不同的染色方法進行染色。染色時滴加染液，以復蓋標本為度。

4．媒染
　　凡能增強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。媒染劑可用于初染與復染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5．脫色
　　凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結合的穩定程度，作為鑒別染色之用。

6．復染
　　已脫色處理的細菌或其結構常以復染液作復染以便于觀察。復染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。

（二）常用染色法（染液配方見第8章）
1. 單染色法
　　只用一種染料染色。由于大多數細菌胞漿內含有酸性物質，可與堿性染料結合，故常用呂氏美藍、結晶紫和稀釋石碳酸復紅等染液。此法可觀察細菌的大小、形態與排列，不能顯示細菌的結構與染色特性。

2．復染色法
　　用兩種或兩種以上不同染料可將細菌染成不同的顏色，除可觀察細菌的大小、形態與排列外，還反應出細菌染色特性，具有鑒別細菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。

（1）革蘭染色：①細菌涂片經火焰固定，加結晶紫染液染1min，清水沖去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復紅或沙黃染液數滴進行復染，約30s，水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。

（2）抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：①細菌涂片經火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現，切不可沸騰。染液因蒸發減少時，應隨時補充，防止染液蒸干。持續染5min（奴卡菌需要加長時間），水洗，甩干。②滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗，甩干。③加呂氏美藍復染液數滴復染1min，水洗。④干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。
金胺O-羅丹明B染色法：①細菌涂片固定后加第1液30~90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1~2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結果 在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。

3．特殊染色法
（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時取出，以干凈紗布擦干。②在玻片上滴蒸餾水1滴。③挑取培養物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min輕輕水洗。⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結果 鞭毛和菌體呈紫色。

（2）異染顆粒染色(阿爾培托法)：①細菌涂片經火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液，染1min。水洗。③干后顯微鏡鏡檢觀察結果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。

（3）莢膜染色：①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液；第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍色或不著色。

（4）芽胞染色：染液：第一液為萋－納氏石炭酸復紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍液。方法：將已固定的細菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復染1min，水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈藍色，芽胞呈紅色。

4．負染色法
　　背景著色而菌體本身不著色的染色為負染色法。最常見的是墨汁負染色法，用來觀察真菌及細菌莢膜等。在標本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細胞，轉高倍鏡或油鏡確認，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。

5．熒光染色法
　　經熒光素染色的細菌，或熒光素標記的熒光抗體與相應抗原的細菌、病毒結合形成的復合物，在熒光顯微鏡下發出熒光。

微生物培養與分離方法

　　大多數細菌均可以通過人工方法培養，而衣原體和病毒的分離培養往往需要活組織、雞胚、特殊細胞株及動物接種。只有將微生物培養出來才能對它進行研究、鑒定和應用。

一、接種與分離方法
　　根據待檢標本的性質、培養目的和所用培養基的種類，采用不同的接種方法。

1．平板劃線分離培養法
　　對混有多種細菌的臨床標本，采用劃線分離和培養，使原來混雜在一起的細菌沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個菌落，以獲得純種。臨床送檢的標本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細菌檢驗均需要借助瓊脂平板劃線分離目的菌。平板劃線分離法通常有兩種方法：
（1）分區劃線分離法：此法常用于含菌量較多的標本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細菌的分離。先用接種環挑取標本涂布于瓊脂平板1區（占培養基總面積的?）并作數條劃線，再于2、3、4區依次劃線。每劃完一個區域，均將接種環燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區域，每一區域的劃線均與上一區域的劃線交接1~3次。一個成功分區劃線的平板，培養后分別觀察1區形成菌苔，2區菌落連成線，3區和4區可分離到單個菌落。
（2）連續劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標本或培養物中的細菌分離培養。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環或拭子在平板表面曲線連續劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面。

瓊脂斜面接種法
　　主要用于菌落的移種，以獲得純種進行鑒定和保存菌種等。用接種環（針）挑取單個菌落或培養物，從培養基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續劃線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。

3．穿刺接種法
　　此法多用于半固體培養基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養基接種，半固體培養基的穿刺接種可用于觀察細菌的動力。接種時用接種針挑取菌落，由培養基中央垂直刺入至距管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。

4．液體培養基接種法
　　用于各種液體培養基如肉湯、蛋白胨水、糖發酵管等的接種。用接種環挑取單個菌落，傾斜液體培養管，在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體淹沒接種物為準）。此接種法應避免接種環與液體過多接觸，更不應在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠，造成實驗室污染。

5．傾注平板法
　　本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標本中的細菌計數。取純培養物的稀釋或原標本1ml至無菌培養皿內，再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養基15~20ml傾注入該無菌培養皿內，混勻，待凝固后置37℃培養，長出菌落后進行菌落計數，以求出每毫升標本中所含菌數。先數6個方格（每格為1cm2）中菌落數，求出每格的平均菌落數，并算出平皿直徑，然后按下列公式計數，求出每毫升標本中的細菌數。
全平板菌落數=每方格的平均菌落數×лr2
每ml標本中的細菌數=全平板菌落數×稀釋倍數

6．涂布接種法
　　本法多用于紙片擴散法藥敏試驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養，本法經培養后細菌形成菌苔。

二、細菌的培養方法
　　根據不同的標本及不同的培養目的，可選用不同的培養方法。通常把細菌的培養方法分為需氧培養、二氧化碳培養、微需氧培養和厭氧培養四種。
1．需氧培養
　　是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養，將已接種好的平板、斜面、液體培養基等在空氣中置35℃孵育箱內孵育18~24h，無特殊要求的細菌均可生長。少數生長緩慢的細菌需要培養3-7d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內保持一定的濕度，可在其內放置一杯水。對培養時間較長的培養基，接種后應將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固，以防培養基干裂。

2．二氧化碳培養
　　某些細菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培養，特別是在初次分離時，須在5%~10 %二氧化碳環境中培養才能生長。常用的培養法如下。
（1）二氧化碳培養箱法：二氧化碳孵箱能自動調節二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養物置于孵育箱內閣，孵育一定時間后可直接觀察生長結果。
（2）燭缸培養法：取有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器，將接種好的培養基放入缸內，點燃蠟燭后放在缸內稍高于培養物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內蠟燭燃燒氧逐漸減少，數分鐘后蠟燭自行熄滅，此時容器內二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內孵育。
（3）氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標本的培養皿放入袋內，盡量祛除袋內空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態，執斷袋內已置的二氧化碳產氣管（安瓿）產生二氧化碳，數分鐘內就可達到需要的二氧化碳培養環境，置于35℃孵育箱內孵育。
（4）化學法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例，分別置容器內，連同容器置于玻璃缸內，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35℃孵育箱內孵育。

3．微需氧培養
　　微需氧菌培養在大氣中及絕對無氧環境中均不能生長，在含有5%-6% 氧氣，5%-10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環境中才可生長，將標本接種到培養基上，置于上述氣體環境中，35℃進行培養即微需氧培養法。

4．厭氧培養
　　厭氧菌對氧敏感，培養過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環境。厭氧培養常用的方法有：物理法、化學法、生物法。如厭氧罐培養法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。

三、細菌在培養基上生長特性
1．固體培養基
　　標本或液體培養物劃線接種到固體培養基表面后，單個細菌經分裂繁殖可形成一個肉眼可見的細菌集團，稱為菌落（colony）。
(1)菌落的形態特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規則等）、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。據細菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型： ①光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，新分離的細菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質形成。R型細菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。但也有少數細菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結核分枝菌等。③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細菌、結核桿菌等。

(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。①α溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養基出現1~2mm的草綠色環，為高鐵血紅蛋白所致；②β溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環，是細菌產生的溶血素使紅細胞完全溶解所致；③γ溶血：即不溶血，菌落周圍的培養基沒有變化，紅細胞沒有溶解或缺損。(3)色素：有些細菌產生水溶性色素，使菌落和周圍的培養基出現綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產生的色素有水溶性或脂溶性。

(4)氣味：某些細菌在培養基中生長繁殖后可產生特殊氣味，如銅綠假單胞菌（生姜氣味）、變形桿菌（巧克力燒焦的臭味）、厭氧梭菌（腐敗的惡臭味）、白色假絲酵母菌（酵母味）和放線菌（泥土味）等。

2．液體培養基
　　細菌在液體培養基中有3種生長現象：大多數細菌在液體培養基生長繁殖后呈均勻混濁；少數鏈狀排列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。

3．半固體培養基
　　半固體培養基主要用于細菌動力試驗，有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培養基仍然澄清透明，為動力試驗陰性。

細菌的生物化學試驗

　　各種細菌具有各自獨特的酶系統，因而對底物的分解能力不同，其代謝產物也不同。用生物化學方法測定這些代謝產物，可用來區別和鑒定細菌的種類。利用生物化學方法來鑒別不同細菌，稱為細菌的生物化學試驗或稱生化反應。生物化學試驗的方法很多，主要有以下幾類。

一、碳水化合物的代謝試驗
1．糖（醇、苷）類發酵試驗
（1）原理：不同種類細菌含有發酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產物可因菌種而異。檢查細菌對培養基中所含糖（醇、苷）降解后產酸或產酸產氣的能力，可用以鑒定細菌種類。

(2)方法：在基礎培養基中（如酚紅肉湯基礎培養基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）類。所使用的糖（醇、苷）類有很多種，根據不同需要可選擇單糖、多糖或低聚糖、多元醇和環醇等，見表6-4-1。將待鑒定的純培養細菌接種入試驗培養基中，置35℃孵育箱內孵育數小時到兩周（視方法及菌種而定）后，觀察結果。若用微量發酵管，或要求培養時間較長時，應注意保持其周圍的濕度，以免培養基干燥。

(3)結果：能分解糖（醇、苷）產酸的細菌，培養基中的指示劑呈酸性反應（如酚紅變為黃色），產氣的細菌可在小倒管（Durham小管）中產生氣泡，固體培養基則產生裂隙。不分解糖則無變化。

(4)應用：糖（醇、苷）類發酵試驗，是鑒定細菌的生化反應試驗中最主要的試驗，不同細菌可發酵 不同的糖（醇、苷）類，如沙門菌可發酵葡萄糖，但不能發酵乳糖，大腸埃希菌則可發酵葡萄糖和乳糖。即便是兩種細菌均可發酵同一種糖類，其發酵結果也不盡相同，如志賀菌和大腸埃希菌均可發酵葡萄糖，但前者僅產酸，而后者則產酸、產氣，故可利用此試驗鑒別細菌。

表6-4-1 常用于細菌糖發酵試驗的糖、醇類

單糖 四碳糖：赤蘚糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖
雙糖 蔗糖（葡萄糖＋果糖） 乳糖（葡萄糖＋半乳糖） 麥芽糖（兩分子葡萄糖）
三糖 棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）
多糖 菊糖（多分子果糖） 淀粉
醇類 側金盞花醇 衛茅醇 甘露醇 山梨醇
非糖類 肌醇

2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗
(1)原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進行無氧降解的為發酵型；不分解葡萄糖的細菌為產堿型。發酵型細菌無論在有氧或無氧環境中都能分解葡萄糖，而氧化型細菌在無氧環境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）試驗，可用于區別細菌的代謝類型。

(2)方法：挑取少許純培養物（不要從選擇性平板中挑取）接種2支HL培養管中，在其中一管加入高度至少為0.5cm的無菌液體石蠟以隔絕空氣（作為密封管），另一管不加（作為開放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。

(3)結果： 兩管培養基均不產酸（顏色不變）為陰性；兩管都產酸（變黃）為發酵型；加液體石蠟管不產酸，不加液體石蠟管產酸為氧化型。

(4)應用：主要用于腸桿菌科與其它非發酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細菌為發酵型，非發酵菌為氧化型或產堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發酵型）與微球菌（氧化型）。

3．甲基紅（MR）試驗
(1)原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培養基pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈紅色。如細菌分解葡萄糖產酸量少，或產生的酸進一步轉化為其它物質（如醇、醛、酮、氣體和水），培養基pH在 5.4以上，加入甲基紅指示劑呈桔黃色。

(2)方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培養基中滴加5~6滴甲基紅指示劑，立即觀察結果。

(3)結果判定：呈現紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽性。

(4)應用：常用于腸桿菌科內某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。

4．β－半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）
(1)原理：乳糖發酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發酵乳糖，所有乳糖快速發酵和遲緩發酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。

(2)方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，觀察結果。

(3)結果：呈現亮黃色為陽性，無色為陰性。

(4)應用：可用于遲緩發酵乳糖細菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均可短時間內呈現陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。

5．VP試驗
(1)原理：測定細菌產生乙酰甲基甲醇的能力。某些細菌如產氣腸桿菌，分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進而與培養基中的精氨酸等含胍基的物質結合形成紅色化合物。即V-P試驗陽性。

(2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，輕輕振搖試管，然后加0.2ml 400g/L KOH，輕輕振搖試管30s至1min，然后靜置觀察結果。

(3)結果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性。

(4)應用：主要用于大腸埃希菌和產氣腸桿菌的鑒別。本試驗常與MR試驗一起使用，一般情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細菌不一定都這樣規律，如蜂房哈夫尼亞菌和奇異變形桿菌的VP試驗和MR試驗常同為陽性。

6．膽汁七葉苷水解試驗
（1）原理：在10%~40％膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細菌分解生成的七葉素，七葉素與培養基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子發生反應形成黑色化合物。

(2)方法：將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養基中，35℃孵育18~24h后，觀察結果。

(3)結果：培養基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。

(4)應用：主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。D群鏈球菌本試驗為陽性。

7．淀粉水解試驗
(1)原理：產生淀粉酶的細菌能將淀粉水解為糖類，在培養基上滴加碘液時，可在菌落周圍出現透明區。
(2)方法：將被檢菌劃線接種于淀粉瓊脂平板或試管中，35℃孵育18~24h，加入革蘭碘液數滴，立即觀察結果。
(3)結果：陽性反應，菌落周圍有無色透明區，其它地方藍色；陰性反應，培養基全部為藍色。
(4)應用：用于白喉棒狀桿菌生物型的分型，重型淀粉水解試驗陽性，輕、中型陰性；芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定。

8．甘油復紅試驗
(1)原理：甘油可被細菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去羧基為乙醛，乙醛與無色的復紅生成醌式化合物，呈深紫紅色。
(2)方法：取被檢菌接種于甘油復紅肉湯培養基中，于35℃孵育，觀察2~8d。應同時做陰性對照。
(3)結果：紫紅色為陽性，與對照管顏色相同為陰性。
(4)應用：主要用于沙門菌屬內各菌種間的鑒別。傷寒沙門菌、甲（丙）型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺沙門菌本試驗為陰性，乙型副傷寒沙門菌結果不定，其它不常見沙門菌多數為陽性。

9．葡萄糖酸氧化試驗
(1)原理：某些細菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成α-酮基葡萄糖酸。α-酮基葡萄糖酸是一種還原性物質，可與班氏試劑起反應，出現棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。
(2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖酸鹽培養基中(1ml)，置35℃孵育48h,加入班氏試劑1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷卻，觀察結果。
(3)結果：出現黃到磚紅色沉淀為陽性。不變或仍為藍色為陰性。
(4)應用：主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群。

二、氨基酸和蛋白質的代謝試驗
1．硫化氫試驗
(1)原理：某些細菌能分解含硫氨基酸生成硫化氫，與亞鐵離子或鉛離子結合形成黑色沉淀物。
(2)方法：將待檢菌接種于含硫化物及亞鐵離子的培養基或克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）中，35℃孵育18~24h，觀察有無黑色沉淀出現。或用醋酸鉛紙條，懸掛于KIA管中（白色濾紙，根據試管大小裁剪適當，在熱的50g/L醋酸鉛飽和水溶液中浸泡，然后于50~60℃烘干，121℃15min高壓滅菌備用）。醋酸鉛是最敏感的方法。
(3)結果：有黑色沉淀物為陽性。
(4)應用：主要用于鑒別腸桿菌科細菌，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性，其它菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門菌等。

2．明膠液化試驗
(1)原理：細菌分泌的胞外蛋白水解酶（明膠酶）能分解明膠，使明膠失去凝固能力而液化。
(2)方法：將待檢菌接種于明膠培養基中，35℃孵育24h到7d或更長時間，每24h取出放入4℃冰箱約2h后，觀察有無凝固。
(3)結果：如無凝固，則表示明膠已被水解，液化試驗陽性。如凝固，則繼續培養。
(3)應用：奇異變形桿菌、普通變形桿菌、沙雷菌屬和陰溝腸桿菌等到能液化明膠，腸桿菌科中的其它細菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外，許多假單胞菌也能產生明膠酶而使明膠液化。

3．吲哚試驗（靛基質試驗）
(1)原理：某些細菌有色氨酸酶，能分解色氨酸產生吲哚，吲哚與對二甲氨基苯甲醛形成紅色的玫瑰吲哚。
(2)方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養基中，35℃孵育24~48h，加入靛基質試劑，觀察結果。
(3)結果：紅色為陽性，無色為陰性。
(4)應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定，如大腸埃希菌與產氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌等的鑒別。

4．苯丙氨酸脫氨酶試驗
(1)原理：測定細菌是否產生苯丙氨酸脫氨酶。細菌產生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產生綠色反應。若延長時間，會引起退色。
(2)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸培養基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化鐵試劑4~5滴，立即觀察菌落生長處有無綠色出現。
(3)結果：有綠色出現為陽性。
(4)應用：變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細菌均為陰性。

5．氨基酸脫羧酶試驗
(1)原理：某些細菌可產生氨基酸脫羧酶使氨基酸脫羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培養基變為堿性，可用指示劑指示出來。
(2)方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸（賴氨酸，鳥氨酸或精氨酸）脫羧酶試驗管和1支氨基酸脫羧酶對照管（無氨基酸），各覆蓋至少0.5cm高度的無菌石蠟油，35℃孵育1~4d，觀察結果。
(3)結果：若為溴甲酚紫指示劑，則試驗管紫色為陽性，黃色為陰性，對照管應為黃色。
(4)應用：主要用于某些細菌種間的鑒別，如賴氨酸用于產氣腸桿菌（陽性）與陰溝腸桿菌（陰性）；鳥氨酸用于陰溝腸桿菌（陽性）和克雷伯菌（陰性）；精氨酸用于陰溝腸桿菌（陽性）和產氣腸桿菌（陰性）等。

6．精氨酸雙水解酶試驗
(1)原理：精氨酸經兩次水解后,生成鳥氨酸、氨及二氧化碳。鳥氨酸又在脫羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均為堿性物質，故可使培養基變堿，用指示劑指示出來。
方法：將待檢菌接種于試驗培養上，置35℃孵箱孵育1~4d，觀察結果。
結果：溴甲酚紫指示劑呈紫色為陽性，酚紅指示劑呈紅色為陽性。黃色為陰性。
應用：主要用于腸桿菌科及假單胞菌屬的鑒定。

7．尿素酶試驗
(1)原理：某些細菌能產生尿素酶，分解尿素產生大量的氨，使培養基變堿。
(2)方法：將待檢菌接種于含有尿素的培養基中，35℃孵育18~24h，觀察結果。
(3)結果：紅色為陽性，不變為陰性。
(4)應用：主要用于腸桿菌科變形桿菌屬、普羅威登菌屬、克雷伯菌屬及假單胞菌屬的鑒定。

8．霍亂紅試驗
(1)原理：霍亂弧菌分解色氨酸生成吲哚，并能使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，當加入硫酸后生成亞硝酸吲哚，呈紅色反應。
(2)方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，置35℃孵育24h，加入濃硫酸數滴，觀察結果。
(3)結果：呈紅色者為陽性。
(4)應用：霍亂弧菌呈陽性反應，但本試驗并非霍亂弧菌所特有。凡能產生吲哚并還原硝酸鹽為亞硝酸鹽的細菌，均可呈現陽性反應。

三、碳源和氮源利用試驗
1．枸櫞酸鹽利用試驗
(1)原理：某些細菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，而在此培養基上生長，并分解枸櫞酸鹽生成碳酸鈉，使培養基變堿性。。
(2)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培養基上，置35℃孵育1~4d，逐日觀察結果。
(3)結果：若用溴麝香草酚蘭指示劑，斜面出現菌落或菌苔，培養基變藍色為陽性；無菌落生長，培養基綠色為陰性。
(4)應用：可用此試驗作細菌種屬間鑒定。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性，粘質和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸櫞酸桿菌陽性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸櫞酸鹽。

2．丙二酸鹽利用試驗
(1)原理：某些細菌能利用丙二酸鹽作為唯一碳源，丙二酸鹽被分解生成碳酸鈉，使培養基變堿。
(2)方法：將待檢菌接種于丙二酸鹽培養基中，置35℃孵育24~48h，觀察結果。
(3)結果：培養基由綠色變為藍色為陽性。顏色無變化為陰性。
(4)應用：腸桿菌科中亞利桑那菌和克雷伯菌屬為陽性，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不同生物型反應，其它各菌屬均為陰性。

3．醋酸鈉利用試驗
(1)原理：細菌利用銨鹽作為唯一氮源，同時，利用醋酸鹽作為唯一碳源時，可在醋酸鹽培養上生長，分解醋酸鹽生成碳酸鈉，使培養基變為堿性。
(2)方法：將被檢菌接種于醋酸鹽培養基中，置35℃孵育2~7d，逐日觀察結果。
(3)結果：培養基上有細菌生長，并變為藍色為陽性。
應用：主要用于大腸埃希菌和志賀菌屬的鑒別，前者為陽性，而后者為陰性。

4．馬尿酸鈉水解試驗
(1)原理：某些細菌可具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結合，形成苯甲酸鐵沉淀。
(2)方法：將待檢菌接種于馬尿酸鈉培養基中，置35℃孵育48h，離心沉淀，取上清液0.8ml，加入三氯化鐵試劑0.2ml，立即混勻，經10~15min觀察結果。
(3)結果：出現恒定之沉淀物為陽性。
應用：主要用于B群鏈球菌的鑒定。

5、乙酰胺利用試驗
(1)原理：許多非發酵菌產生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經脫酰胺作用釋放氨，使培養基變堿。
(2)方法：將被檢菌接種于乙酰胺培養基中，置35℃孵育24~48h，觀察結果。
(3)結果：培養基由綠色變為藍色為陽性。如不生長，或稍有生長，但培養基顏色不變為陰性。
(4)應用：主要用于非發酵菌的鑒定。銅綠假單胞菌、去硝化產堿桿菌、食酸假單胞菌為陽性，其它非發酵菌大多數為陰性。

四、酶類試驗
1.氧化酶試驗
(1)原理：氧化酶又稱細胞色素氧化酶，是細胞色素氧化酶系統中的最終呼吸酶。此酶并不直接與氧化酶試劑起反應，而是先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。因此，本試驗結果與細胞色素C的存在有關。
(2)方法：取潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑（10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液）1滴，1min內觀察結果。也可將試劑滴加到菌落上進行試驗。
(3)結果：陽性者立即變粉紅色，5~10s內呈深紫色。無色為陰性。
(4)應用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細菌均陽性。此外，也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細菌的區別，前者陽性，而后者陰性。莫拉菌屬、產堿桿菌屬等均為陽性。
注意事項： ①試驗時應避免接觸含鐵物質，以免出現假陽性。②10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應經常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍色，應棄去不用。

2．觸酶試驗
(1)原理：觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫成為水和原子態氧，繼而形成氧分子，出現氣泡。
(2)方法：取潔凈玻片1張，用接種環挑取細菌，加3％H2O2 1滴，立即觀察結果。
(3)結果：若立即出現大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。
(4)應用：大多需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故常用此試驗來鑒