微生物學檢驗基本技術(2)

第六節 自動化技術在微生物檢驗中的應用

　　微生物鑒定的自動化技術近十幾年得到了快速發展。數碼分類技術集數學、計算機、信息及自動化分析為一體，采用商品化和標準化的配套鑒定和抗菌藥物敏感試驗卡或條板，可快速準確地對臨床數百種常見分離菌進行自動分析鑒定和藥敏試驗。目前自動化微生物鑒定和藥敏分析系統已在世界范圍內臨床實驗室中廣泛應用。本節簡要介紹有關情況。

一、微生物數碼鑒定法
　　早在七十年代中期，一些國外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細菌的新方法。這些技術的應用，為醫學微生物檢驗工作提供了一個簡便、科學的細菌鑒定程序，大大提高了細菌鑒定的準確性。目前，微生物編碼鑒定技術已經得到普遍應用，并早已商品化和形成獨特的不同細菌鑒定系統。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系統。這種鑒定系統是自動化鑒定系統的基礎。

( 一)數碼鑒定法基本原理
數碼鑒定是指通過數學的編碼技術將細菌的生化反應模式轉換成數學模式，給每種細菌的反應模式賦予一組數碼，建立數據庫或編成檢索本。通過對未知菌進行有關生化試驗并將生化反應結果轉換成數字（編碼），查閱檢索本或數據庫，得到細菌名稱。其基本原理是計算并比較數據庫內每個細菌條目對系統中每個生化反應出現的頻率總和。隨著電腦技術的進步，這一過程已變得非常容易。

1．簡要介紹計算步驟：
(1)出現頻率（概率）的計算：將記錄成陽性或陰性結果轉換成出現頻率：①對陽性特征，則除以100即得。②對陰性特征，除以100的商被1減去即可。③說明：對“0”和“100”，因這2個數太超量，為了使結果不出現過小或過大，而用相似值0.01或0.99值代替。
(2)在每一個分類單位中，將所有測定項目的出現頻率相乘，得出總出現頻率。
(3)在每個分類菌群中的所有菌的總出現頻率相加，除以一個分類單位的總出現頻率，乘100，即得鑒定%（%id）
(4)在每個菌群中，再按%id值大小順序重新排列。將未知菌單次總發生頻率除以最典型反應模式單次總發生頻率，得到模式頻率T值，代表個體與總體的近似值。T值越接近1，個體與總體越接近，鑒定價值越大。按%id大小排序，將相鄰兩項的%id之比為R，代表著首選條目與次選條目的差距，差距越大，價值越大。如果%id≥80，參考T及R值可作出鑒定。

2．在編碼檢索本中檢索數據譜得出的結果有以下幾種形式（以API鑒定系統為例）。
(1)有此數碼譜:①有一個或幾個菌名條目及相應的鑒定值（%id和T值）。②對鑒定結果好壞的評價，最佳……等。③用小括號列出關鍵的生化結果及陽性百分率。④有時，鑒定結果不佳或有多條菌名條目,需進一步補充試驗項目才能得出良好的鑒定結果。⑤指出某些注意要點，需用“推測性鑒定”，并將此菌送至參考實驗室；需用“血清學鑒定”，作進一步的證實等。
(2)無此數碼譜：可能有以下原因：①此生化譜太不典型。②不能接受，鑒定值低(%id＜80.0)。③可疑。需進一步確認是否純培養，重新鑒定，可與供應商技術服務部聯系。

3. 結果解釋
(1)如果排序第一的細菌%id≥80.0，則可將未知菌鑒定在此條目中，并按%id值的大小對鑒定的可信度作出評價。%id≥99.9和T≥0.75為最佳的鑒定；%id 99.0~98.9之間，T≥0.5為很好的鑒定；%id 90.0~98.9之間，T≥0.25為好的鑒定；%id 80.0~89.9之間為可接受的鑒定。
(2)如果第一條目的%id＜80.0，則將前2個條目的%id加在一起，若仍不足80.0，則將前3個%id相加。若≥80.0，則有2種可能：①為同種細菌，可能是不同生物型。②為同一菌屬的不同種。
如果相加的幾個條目既不屬于同一細菌種，又不屬于同一細菌屬，在評價中會指出“補充生化反應”的項目及陽性反應率，可通過這些生化反應將幾種菌區分開來。若前3個條目的和＜80.0，則為不可接受的結果。
(二)數碼鑒定在臨床上的應用
國內外已有許多種用于臨床細菌鑒定的數碼鑒定系統，為臨床微生物學實驗室對細菌的鑒定提供了簡便、快速的方法。目前常見微生物鑒定系統見表6-4-3
表6-4-3 目前常見微生物鑒定系統

生產廠商 系統名稱 可鑒定的微生物 孵育時間及條件
ANI 厭氧菌 ４h；需氧
API20A 厭氧菌 2４h；厭氧
API An-IDENT 厭氧菌 ４h；需氧
API Staph（STAPH－Trac） 葡萄球菌、微球菌 2４h
GPI 革蘭陽性球菌和桿菌 2~15h
ID32 Staph 葡萄球菌 24h
API Coryne(Rapid CORYNE) 棒狀桿菌及相關菌 24h
API 20Strep(Rapid STREP) 鏈球菌、腸球菌 ４~24h
API 20E 腸桿菌科、非發酵菌 2４~48h
EPS (Enteric Pathogen Screen） 愛德華菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、耶爾森菌屬 ４~8h
GNI 腸桿菌科、非發酵菌 2~18h
GNI＋ 腸桿菌科、非發酵菌 2~12h
UID／UID-3 尿液來源尿道致病菌 1~13h
YBC 酵母菌 24~48h
API 20C AUX 酵母菌 48~72h

Crystal Anaerobe 厭氧菌 ４h
Crystal E/NF 腸桿菌科、某些革蘭陰性非發酵菌 18~2４h
Crystal Gram Positive 革蘭陽性球菌和桿菌 18~2４h
Crystal MRSA ID MRSA ４h
Crystal Neisserial/Haemophilus 奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、莫拉菌屬、加德納菌屬、其它的苛養菌 ４h
Crystal Rapid Gram Positive 革蘭陽性球菌和桿菌 ４h

Crystal Rapid stool/Enteric 革蘭陰性腸道致病菌 ３h
Enterotube Ⅱ 腸桿菌科 18~24h
ID Tri-Panel 革蘭陰性和陽性菌 16~20h；40~44h
MiniTek 厭氧菌、腸桿菌科、革蘭陽性菌、奈瑟菌屬、非發酵菌、酵母菌 4h（腸桿菌科、奈瑟菌屬）
72h（酵母菌）

Oxi／FermⅡ 革蘭陰性、氧化酶陽性葡萄糖發酵或不發酵菌
24~48h
NEG ID Type2 腸桿菌科、其它的發酵和非發酵菌 15~42h
Pos ID 革蘭陽性球菌和李斯特菌屬 18~48h
Rapid Anaerobe 厭氧菌 4h；需氧
Rapid HNID 奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、卡他莫拉菌、陰道加德納菌 4h
Rapid NEG ID Type2 腸桿菌科、其他的發酵和非發酵菌 2h
Rapid NEG ID Type3 腸桿菌科、其他的發酵和非發酵菌 2.５h
Rapid Pos ID 革蘭陽性球菌和李斯特菌屬 2h
Rapid Yeast ID 酵母菌 4h

Micro-ID 腸桿菌科 4h
RapID ANAⅡ 厭氧菌 4~6h；需氧
RapID CB Plus 棒狀桿菌 4h
RapID NF Plus 非發酵革蘭陰性桿菌 4h
RapID NH 奈瑟菌、嗜血桿菌和其它革蘭陰性細菌 4h；1h(淋球菌)
RapID onE 腸桿菌科和其它氧化酶陰性菌 4h
RapID STR 鏈球菌 4h
RapID Yeast Plus 酵母菌和酵母菌樣菌 4h

AN 厭氧菌 4~16h；需氧
GN Microplate 需氧革蘭陰性桿菌 4~24h
GP Microplate 大多數革蘭陽性球菌和桿菌 4~24h
YT 酵母菌 24~72h
Neisseria Enzyme test 奈瑟菌屬、莫拉菌屬 30min
r/b Enteric Differential System 腸桿菌科 18~24h
Uni-Yeast Tek 酵母菌 24h~6d
Uni-N/F-Tek 革蘭陰性發酵或不發酵細菌 24~28h
Medical Specialties Inc. Fox Exera GNI 腸道和非腸道革蘭陰性桿菌 18~24h
AccuMed International, Inc. Sensititre AP 80 腸桿菌科和非發酵革蘭陰性桿菌 5~18h

二、自動化的微生物鑒定和藥敏試驗分析系統
　　自動化的微生物鑒定和藥敏試驗分析系統在臨床微生物實驗室的應用，為微生物檢驗工作者對病原菌的快速診斷和藥敏試驗提供了有力工具。鑒定系統的工作原理因不同的儀器和系統而異。不同的細菌對底物的反應不同是生化反應鑒定細菌的基礎，而試驗結果的準確度取決于鑒定系統配套培養基的制備方法、培養物濃度、孵育條件和結果判定等。大多鑒定系統采用細菌分解底物后反應液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解，測定揮發或不揮發酸，或識別是否生長等方法來分析鑒定細菌。各種微生物鑒定系統的反應基礎見表6-4-4。
藥敏試驗分析系統的基本原理是將抗生素微量稀釋在條孔或條板中，加入菌懸液孵育后放入儀器或在儀器中直接孵育，通過測定細菌生長的濁度，或測定培養基中熒光指示劑的強度或熒光原性物質的水解，觀察細菌的生長情況。在含有抗生素的培養基中，濁度的增加提示細菌生長，根據判斷標準解釋敏感或耐藥。

表 6-4-4 各種微生物鑒定系統的反應基礎

系統源性 需要培養 分析 陽性結果指示 系統舉例
酶譜分析
(通常2~4h) 不需要 酶活性 色原性／熒光性底物混合物被酶水解后產生顏色變化 MicroScan Rapid panels、IDS
pH為基礎的反應
（通常15~24h） 需要 碳水化合物利用 pH指示顏色變化 碳水化合物分解產酸，蛋白質或含氮化合物被水解產堿 API、Crystal、VITEK cards、 Micro Scan conventional panels
碳源利用 需要 有機物 無色變為紫色 Biolog
揮發性和不揮發酸測定 需要 細胞脂肪酸 氣相色譜鑒定終末產物與已知圖譜比較 MIDI
肉眼觀察生長 需要 各種底物 混濁生長 酵母菌鑒定

半自動化細菌鑒定和/或藥敏分析系統
1．VITEK-ATB半自動細菌鑒定和藥敏分析系統
VITEK-ATB是生物-梅里埃公司產品，由計算機和讀數器兩部分組成，計算機程序包括ATB和API的鑒定數據庫、ATB的藥敏數據庫、數據儲存和分析系統及藥敏專家系統。鑒定和藥敏反應板在機外孵育后，一次性上機讀取結果，由計算機進行分析和處理，并報告細菌鑒定和藥敏結果。

2．AutoScan-4半自動細菌鑒定和藥敏分析系統
AutoScan-4是由Dade MicroScan公司生產，由計算機和讀數器兩部分組成。鑒定和藥敏反應板在機外孵育后，一次性上機，自動判讀鑒定和藥敏試驗結果；亦可人工進行判讀，將編碼輸入計算機，由計算機軟件評定結果。有鑒定及鑒定藥敏復合板兩種測試卡。

3．BBLTM CrystalTM半自動細菌鑒定系統
BBLTM CrystalTM半自動細菌鑒定系統是BD公司產品，將傳統的酶、底物生化呈色反應與先進的熒光增強顯色技術結合以設計鑒定反應最佳組合。反應板在機外孵育后，上機自動判讀鑒定結果。配套提供獨立分裝的鑒定用肉湯試管，確保無菌狀態，使用方便。配套比濁儀可快速調配所需濁度的菌液

4．AutoReader半自動細菌鑒定和藥敏分析系統
AutoReader半自動細菌鑒定和藥敏分析系統是Trek Diagnostic Systems LTD.產品，由計算機和讀數儀等組成。采用熒光測定法，反應板在機外作定時孵育后，上機讀數，由SAMS軟件評定測定結果，也可通過SAMS系統人工確認法輸入計算，或完全由人工輸入作評定。所用鑒定板和藥敏板與全自動機型中的反應板是一樣的。

5．抑菌圈直徑測量儀
抑菌圈直徑測量儀有BIOMIC（Giles Scientific Inc），AccuZone System (AccuMed International Inc) ，SIRSCAN (SIRSCAN) 等三種單板讀取機，已在臨床應用。經孵育后的藥敏平板，被儀器的圖象分析系統識別并計算抑菌圈直徑。根據判斷標準，報告藥敏試驗結果。這些儀器可減少人工測量抑菌圈直徑大小差異及主觀判斷錯誤。BIOMIC系統宣稱能根據抑菌圈大小來計算MIC，值得注意的是該類儀器對抑菌圈內模糊生長或微小的菌落不能正確識別，而這些菌落對細菌的耐藥性的判定至關重要，讀取每個平板時必須進行人工觀察。

（二）全自動的微生物鑒定和藥敏試驗分析系統
1．VITEK 系統
VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生產的全自動微生物鑒定和藥敏分析系統。第一代產品有以下四個規格VITEK AMS 32、60、120、240。由計算機主機、孵育箱/讀取器、充填機/封口機、打印機等組成。鑒定原理是根據不同微生物的理化性質不同，采用光電比色法，測定微生物分解底物導致pH改變而產生的不同顏色，來判斷反應的結果。在每張卡上有30項生化反應。由計算機控制的讀數器，每隔1h對各反應孔底物進行光掃描，并讀數一次，動態觀察反應變化。一旦鑒定卡內的終點指示孔到臨界值，則指示此卡已完成。系統最后一次讀數后，將所得的生物數碼與菌種數據庫標準菌的生物模型相比較，得到相似系統鑒定值，并自動打印出實驗報告。
獲得細菌的純培養后，調整菌懸液濃度，根據不同的細菌選擇相應的藥敏試驗卡片，在充液倉中對卡片進行充液。置孵育箱／讀數器中孵育，自動定時測試、讀取數據和判斷結果。VITEK可快速鑒定包括各種腸桿菌科細菌、非發酵細菌、苛氧菌、革蘭陽性球菌、革蘭陰性球菌、厭氧菌和酵母菌等500種臨床病原菌。具有20多種藥敏測試卡、97種抗生素和測定超廣譜β-內酰胺酶測試卡，快速檢測細菌藥敏情況。
該系統有根據細菌耐藥規律而設定的專家系統，可幫助校正和修改結果。對于專家系統提示的不可能的或極少見的耐藥表型應予以充分重視，需采用確認試驗重新鑒定。如對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌，對泰能耐藥的腸桿菌，對青霉素耐藥的β溶血性鏈球菌等。
VITEK-2是生物-梅里埃公司開發的新一代微生物分析儀，其工作原理與VITEK AMS沒有大的差別，但它的容量更大，自動化程度更高，并且使用64孔的反應卡片，鑒定更準確可靠，可同時測定20種抗生素的藥敏試驗。

2. MicroScan Walk/ Away系統
MicroScan Walk/ Away系統由主機、真空加樣器、孵育箱/讀取器、計算機、打印機等組成。除采用傳統呈色反應法外，同時采用敏感度極高的快速熒光測定技術來檢測細菌胞外酶，鑒定板有普通板和快速板兩種，普通板獲得結果需要16~18h，快速板測定只需2~3.5h。該系統有8種鑒定反應板，可鑒定包括革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、厭氧菌、酵母菌、嗜血桿菌和奈瑟菌等近800種細菌。藥敏部分采用比濁法進行測定，90％菌株可在5.5h內獲得對17~33種抗菌藥物的MIC值。此系統有walk / Away－40和96兩個型號，40或96分別代表該系統可同時容納40或96個測試板。

3．PHOENIXTM 系統
PHOENIXTM System是新一代全自動快速細菌鑒定/藥敏系統，由BD公司生產。鑒定試驗采用BDZL熒光增強技術與傳統酶、底物生化呈色反應相結合的原理。藥敏試驗采用傳統比濁法和BDZL呈色（Chromogenic）反應雙重標準進行藥敏試驗結果判斷。儀器由主機、比濁儀、微生物專家系統等組成。有PHOENIXTM 100或50 二種型號。PHOENIXTM 100型分別可進行100個鑒定試驗和100個藥敏試驗。可鑒定革蘭氏陽性菌139種、革蘭氏陰性菌158種。有鑒定板、藥敏板或鑒定/藥敏復合板3種可供選擇。每個鑒定藥敏復合板有51孔用于鑒定試驗，85孔用于藥敏試驗，可同時進行17種抗菌素5種濃度或28種抗菌素3種濃度的MIC藥敏試驗。90%細菌的鑒定在3~6h完成，鑒定準確率大于90%，85%的細菌藥敏試驗在4~6h內出結果。

4．SENSITITRE　ARIS系統
該系統由計算機主機、孵育箱/讀數儀、全自動加樣器等組成。在培養箱中設置可存放64塊板的轉盤，每塊板均能檢測3個標本，故同時可檢測192個菌種標本。在測定板底物中加入酶基質，使其與細菌產生的酶結合成熒光物質。在較短時間內能夠分析不同生化底物所反映出的熒光物質，通過熒光讀數儀檢測板孔中熒光Biocide和Willcox值來鑒定細菌。該系統的藥敏試驗有兩種測定法，即當采用人工判定時為比濁法，當采用儀器自動判讀時為熒光測定法。但均參照NCCLS的標準和規則來解釋結果。大多數菌種均可在5小時內報告檢驗結果。通常有革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、厭氧菌、苛氧菌及真菌鑒定板和300多種抗菌藥物不同組合的藥敏板及鑒定/藥敏復合板。

(三)使用自動化鑒定儀的局限性
1．自動化鑒定系統是根據數據庫中所提供的背景資料鑒定細菌，數據庫資料的不完整將直接影響鑒定的準確性。目前為止，尚無一個鑒定系統能包括所有的細菌鑒定資料。對細菌的分類是根據傳統的分類方法，因此鑒定也以傳統的手工鑒定方法為“金標準”。使用自動化鑒定儀的實驗室，應對技術人員進行手工鑒定基礎與操作技能培訓。
2．細菌的分類系統隨著人們對細菌本質認識的加深而不斷演變，使用自動化鑒定儀的實驗室應經常與生產廠家聯系，及時更新數據庫。實驗室技術人員應了解細菌分類的最新變化，便于在系統更新之前即可進行手工修改。
3．通過自動化鑒定儀得出的結果，必須與其它已獲得的生物性狀（如標本來源、菌落特征及其它的生理生化特征）進行核對，以避免錯誤的鑒定。

三、自動化的血液細菌培養系統
　　正常血液是無菌的，細菌侵入可導致菌血癥、敗血癥、膿毒血癥，及時準確地進行病原學診斷極為重要。傳統的血培養是抽取5ml血液注入血培養瓶中，放入孵箱，每天觀察結果，費時費力，不能及時發陽性結果，易延誤診斷。
全自動血液細菌培養儀主要優點是可以在較短培養時間內提示出血液培養瓶中有無微生物的存在。

1．BACTEC系列
BACTEC460、NR-730是早期的血液培養儀，目前基本上已被BACTEC9000系列替代（包括9050、9120和9240三種型號，可分別容納50、120和240個培養瓶）。微生物在生長過程中消耗培養基內的營養物質，產生的二氧化碳直接激活瓶底部預埋的對二氧化碳濃度變化高度敏感的熒光物質，在激發光的激發下放出熒光，熒光的強度變化直接反映瓶內二氧化碳濃度變化，來判斷瓶內有無微生物生長。根據不同的培養要求，該系統配置了標準需氧／厭氧培養瓶、有中和抗菌藥物的樹脂培養瓶、厭氧菌和真菌等多種培養瓶。細菌培養生長曲線、結果等均可在聯機的計算機上顯示出來。

2．BacT／Alert系統
該系統有BacT／Alert48、72、96、120、240及3D等型號。主要測定原理為當培養瓶內有微生物生長，代謝過程中產生的二氧化碳可經過半透膜滲透至瓶底，與固定于瓶底的Novel／CO2感應器結合，產生顏色變化，通過光電檢測得知二氧化碳變化情況。通過計算機處理后，在曲線圖上反映、分析、判斷陰性或陽性結果，并及時報警。該系統可在任何時間內放入培養瓶，通過條碼識別允許該標本進入系統，并連續跟蹤監測。系統配置有需氧培養瓶、厭氧培養瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厭氧瓶、小兒培養瓶、血液分枝桿菌培養瓶和痰液分枝桿菌培養瓶等。

3. VITAL系統
主要測定原理為使用均質熒光技術的快速培養系統，培養瓶內的液體培養基中含有熒光底物，當細菌生長后，產生的質子、電子和離子與熒光分子結合后，使熒光物變成無熒光化合物，通過測量每瓶內熒光強度來反映細菌生長情況。

4．ESP血培養系統
主要測定原理為細菌在生長過程中消耗氧，產生氮氣、氫氣和二氧化碳，導致培養瓶內壓力改變。該系統采用氣壓傳感技術，通過壓力傳感器監測瓶內壓力變化，報警提示有細菌生長。

四、結核分枝桿菌快速檢測系統
結核分枝桿菌的經典培養是將標本接種在特定培養基上，定時觀察，15天后生長的為可疑菌落。判定陰性需8周時間，要完成陽性病例的鑒定、藥物敏感試驗需2~3個月，且陽性率低，不易標準化。二十世紀七十年代以來，采用14C棕櫚酸作為底物快速檢測結核分枝桿菌，使快速分離及鑒定結核分枝桿菌成為可能。第一代的儀器為BD公司的BACTEC 460TMTB培養儀，由于14C的放射性環境污染及探針穿刺開放等缺陷，基本上已被淘汰。BACTEC 9000系列為了克服放射性的缺陷，改用熒光增強技術。由于分枝桿菌的生長需要添加一定濃度的二氧化碳，因此檢測培養瓶中氧濃度的變化比二氧化碳濃度的變化更加敏感直接。BACTEC 9000系列利用對氧濃度敏感的熒光物質，來測定培養瓶中結核分枝桿菌的生長。BACTECTMMYCO／FTIC（含溶血素分枝桿菌／真菌培養瓶）適用于血液及無菌體液中結核分枝桿菌和真菌的檢測。由于添加了溶血素，破壞了紅細胞等血細胞對氧的利用，避免了假陽性。BACTECTMMYCO／FSPuta培養適用于其它污染標本的使用。在此二種瓶中有陽性生長時，需鑒別是結核分枝桿菌還是真菌及其它細菌生長所引起的陽性，它們僅適用于結核分枝桿菌的篩查。

BACTEC960和BacT／ALERT3D系統，可進行結核分枝桿菌的初代培養、陽性結果的鑒定和藥敏試驗。通過對標本的消化處理后，接種分枝桿菌快速培養管。培養管的基本組成為：①改良Middle Brook 7H9分枝桿菌專用增菌肉湯。②抗菌劑 兩性霉素B，阿洛西林，奈啶酸，多粘菌素B，甲氧嘧啶，萬古霉素。③營養添加劑。平均陽性檢出時間為9~13d，鑒定4~5d。大大加快了結核分枝桿菌的檢出。

還有一些適用于小型實驗室的手工結核分枝桿菌快速鑒定系統。包括標本前處理管、結核分枝桿菌快速生長管、鑒定試驗管、藥敏試驗管及熒光判讀器。

3．16S rRNA同源性分析
(1) rRNA-DNA雜交：變性rRNA與變性DNA混合時，rRNA與其互補的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時，也能在其同源區形成互補雙鏈，這種雜交雙鏈的穩定性與其同源性成正相關，適于細菌屬及屬上水平的分類研究。現最常用的是硝酸纖維膜結合法。
(2)16S rRNA序列測定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的細胞生物中都存在，在長期的進化中，16S rRNA的總堿基數有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對齊進行比較。1985年Lane等提出了改良的Sanger雙脫氧鏈終止法測定rRNA序列，以rRNA為模板，以一個或多個寡核苷酸鏈做引物（與rRNA分子上的一段保守區域互補的15~20個核苷酸），用反轉錄酶合成反轉錄DNA。隨著PCR技術的成熟，出現了利用PCR技術擴增16S rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，該法比前者更方便。當前的細菌分類要求測定16S rRNA基因的全序列來進行比較。16S rRNA基因序列分析技術是建立系統分類的主要技術，有人建議DNA相關性≥70%，16S rRNA序列差異≤1%~1.5%的細菌屬于同一種，這使細菌的種有一個穩定和統一的標準。

二、分子生物學技術在細菌鑒定中的應用
十九世紀，細菌的鑒定主要依靠細菌的表型特征，因耗時長，往往耽誤了對疾病診斷與治療。隨著分子生物學技術的發展及在臨床微生物學檢驗中的應用，為微生物學實驗室對細菌的快速鑒定，尤其是對難分離細菌的快速鑒定，提供了有利條件。目前在細菌鑒定中應用的分子生物學技術主要有核酸探針和核酸擴增技術等。

1．核酸探針技術
應用核酸探針技術檢測病原微生物核酸是臨床診斷學的重大發展，其原理是用帶有酶、化學熒光物、放射性核素或生物素標記的已知序列特定DNA片段（稱為探針），在一定條件下，按堿基互補原則探針與待測標本中的核酸雜交，通過對雜交信號的檢測，從而鑒定標本中有無相應的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探針技術有固相雜交（斑點雜交、原位雜交、Southern印跡、Northern印跡等。）和液相雜交技術。
核酸探針適用于直接檢出臨床標本中的病原微生物，不受非病原微生物的影響，因此對某些尚不能分離培養或很難分離培養的微生物的檢測具有重要的意義。隨著探針標記的不斷改進，檢測試劑盒商品化，操作更簡便易行。

核酸擴增技術
核酸擴增（又稱基因或DNA擴增）技術是體外酶促合成DNA片段的新方法，其原理類似于DNA的體內半保留復制。主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環構成。即在高溫下（95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37~55℃）情況下，兩條人式合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物的3`端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5` 3`方向延伸，合成DNA新鏈。這樣每一雙鏈DNA模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，每一次循環都使人工合成的引物間的DNA特異區段拷貝數擴增一倍。經過上述25~40個循環后，靶序列可以擴增成106~108。

核酸擴增技術（或稱聚合酶鏈反應技術，PCR）具有高敏感性、高特異性、簡便、快速等特點，臨床實驗室常用PCR技術來檢測標本中某些微生物，尤其是對難以培養微生物的檢測。其它用于檢測微生物的PCR技術還有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和隨機引物PCR等。核酸擴增技術在臨床微生物學檢驗中的應用見表6-4-2。

表6-4-2 核酸擴增技術在臨床微生物學檢驗中的應用

微生物種類 核酸擴增技術 應 用
金黃色葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測
凝固酶陰性葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測
肺炎鏈球菌 PCR 自溶酶和青霉素結合酶的檢測
化膿性鏈球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型

淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物標本直接檢測
百日咳桿菌 PCR、巢式PCR 臨床標本檢測
結核分枝桿菌
PCR、SDA、Qbeta 肺結核的診斷、呼吸道標本檢測、臨床標本直接檢測
鳥分枝桿菌復合群 PCR 鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的區別
白喉棒狀桿菌 PCR 產毒菌株的檢測
腸致病性大腸埃希菌 多重PCR 產毒菌株檢測
傷寒、副傷寒沙門菌 PCR 耐藥質粒分型和檢測
幽門螺桿菌 多重PCR 胃活檢組織細菌檢測
小腸結腸炎耶爾森菌 PCR 菌株分型
彎曲菌屬 PCR 通過16s rRNA鑒定
杜克雷嗜血桿菌 多重PCR 生殖道潰瘍病人的直接檢測
嗜肺軍團菌 PCR 與爆發相關菌株的分型
金氏桿菌屬 PCR 臨床標本鑒定
念珠菌屬 PCR 通過“DNA”指紋鑒定
梅毒螺旋體 多重PCR 生殖道潰瘍標本直接檢測
伯氏螺旋體 巢式PCR 治療前、中、后檢測
問號狀鉤端螺旋體 PCR 鉤端螺旋體血清型的鑒定
CDC group Ⅳ 群 PCR 分型
沙眼衣原體 PCR 無癥狀病人的診斷
三、分子生物學技術在細菌藥敏試驗中的應用
分子生物學技術在檢測耐藥基因方面日益受到重視。臨床上可用PCR方法檢測耐藥基因，來判斷待檢菌對某種抗菌藥物是否具有耐藥性。但某些沉默耐藥基因，如不表達相應產物，則可能不表現耐藥表型。現在已有檢測耐藥基因的DNA探針和PCR商品化試劑盒供應，但多用于實驗研究，常規工作中開展較少。目前能檢測的耐藥基因有：
β-內酰胺類
mecA、blaTEM、blaROB-1、blaSHV、blaIMP、blaMIR-1、blaOXA、blaPER-1、blaPER-2、blaOXY-1、blaOXA-10/11。
氨基糖苷類
aph（3’）—Ⅲ、aph（3’）—Ⅵ、ant（2〃）Ia、ant（4’）-Ia、aac（3） -Ia、acc（6’）-Ia、aac（3）-Va、aac（6’）-aph（2〃）、ant（4’）、ant（6’）-Ia、aac（6’）-Ic、aac（3）-Ib、aad（2〃）-Ia、ant（6）-I、aph（2〃）-Ic。
氯霉素
catP、catQ、catD、catI
環內酯類
ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。
磺胺類
sulⅠ、sulⅡ,sulA。
四環素
tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。
甲氧芐啶
dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、dhfrⅧ。
8．糖肽類
vanA、vanB、vanB2, vanC1、vanC3、vanD。
9．喹諾酮類
gyrA、gyrB、parE。
10．乙胺丁醇
embB。
11．吡嗪酰胺
pncA。
12．利福平
rpoB。
13．鏈霉素
rpsL、rrs。
14．異煙肼
katG、inhA、ahpC。

第六節 自動化技術在微生物檢驗中的應用

微生物鑒定的自動化技術近十幾年得到了快速發展。數碼分類技術集數學、計算機、信息及自動化分析為一體，采用商品化和標準化的配套鑒定和抗菌藥物敏感試驗卡或條板，可快速準確地對臨床數百種常見分離菌進行自動分析鑒定和藥敏試驗。目前自動化微生物鑒定和藥敏分析系統已在世界范圍內臨床實驗室中廣泛應用。本節簡要介紹有關情況。

一、微生物數碼鑒定法
早在七十年代中期，一些國外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細菌的新方法。這些技術的應用，為醫學微生物檢驗工作提供了一個簡便、科學的細菌鑒定程序，大大提高了細菌鑒定的準確性。目前，微生物編碼鑒定技術已經得到普遍應用，并早已商品化和形成獨特的不同細菌鑒定系統。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系統。這種鑒定系統是自動化鑒定系統的基礎。

( 一)數碼鑒定法基本原理
數碼鑒定是指通過數學的編碼技術將細菌的生化反應模式轉換成數學模式，給每種細菌的反應模式賦予一組數碼，建立數據庫或編成檢索本。通過對未知菌進行有關生化試驗并將生化反應結果轉換成數字（編碼），查閱檢索本或數據庫，得到細菌名稱。其基本原理是計算并比較數據庫內每個細菌條目對系統中每個生化反應出現的頻率總和。隨著電腦技術的進步，這一過程已變得非常容易。
1．簡要介紹計算步驟：
(1)出現頻率（概率）的計算：將記錄成陽性或陰性結果轉換成出現頻率：①對陽性特征，則除以100即得。②對陰性特征，除以100的商被1減去即可。③說明：對“0”和“100”，因這2個數太超量，為了使結果不出現過小或過大，而用相似值0.01或0.99值代替。
(2)在每一個分類單位中，將所有測定項目的出現頻率相乘，得出總出現頻率。
(3)在每個分類菌群中的所有菌的總出現頻率相加，除以一個分類單位的總出現頻率，乘100，即得鑒定%（%id）
(4)在每個菌群中，再按%id值大小順序重新排列。將未知菌單次總發生頻率除以最典型反應模式單次總發生頻率，得到模式頻率T值，代表個體與總體的近似值。T值越接近1，個體與總體越接近，鑒定價值越大。按%id大小排序，將相鄰兩項的%id之比為R，代表著首選條目與次選條目的差距，差距越大，價值越大。如果%id≥80，參考T及R值可作出鑒定。

2．在編碼檢索本中檢索數據譜得出的結果有以下幾種形式（以API鑒定系統為例）。
(1)有此數碼譜:①有一個或幾個菌名條目及相應的鑒定值（%id和T值）。②對鑒定結果好壞的評價，最佳……等。③用小括號列出關鍵的生化結果及陽性百分率。④有時，鑒定結果不佳或有多條菌名條目,需進一步補充試驗項目才能得出良好的鑒定結果。⑤指出某些注意要點，需用“推測性鑒定”，并將此菌送至參考實驗室；需用“血清學鑒定”，作進一步的證實等。
(2)無此數碼譜：可能有以下原因：①此生化譜太不典型。②不能接受，鑒定值低(%id＜80.0)。③可疑。需進一步確認是否純培養，重新鑒定，可與供應商技術服務部聯系。

3. 結果解釋
(1)如果排序第一的細菌%id≥80.0，則可將未知菌鑒定在此條目中，并按%id值的大小對鑒定的可信度作出評價。%id≥99.9和T≥0.75為最佳的鑒定；%id 99.0~98.9之間，T≥0.5為很好的鑒定；%id 90.0~98.9之間，T≥0.25為好的鑒定；%id 80.0~89.9之間為可接受的鑒定。
(2)如果第一條目的%id＜80.0，則將前2個條目的%id加在一起，若仍不足80.0，則將前3個%id相加。若≥80.0，則有2種可能：①為同種細菌，可能是不同生物型。②為同一菌屬的不同種。
如果相加的幾個條目既不屬于同一細菌種，又不屬于同一細菌屬，在評價中會指出“補充生化反應”的項目及陽性反應率，可通過這些生化反應將幾種菌區分開來。若前3個條目的和＜80.0，則為不可接受的結果。
(二)數碼鑒定在臨床上的應用
國內外已有許多種用于臨床細菌鑒定的數碼鑒定系統，為臨床微生物學實驗室對細菌的鑒定提供了簡便、快速的方法。目前常見微生物鑒定系統見表6-4-3
表6-4-3 目前常見微生物鑒定系統

生產廠商 系統名稱 可鑒定的微生物 孵育時間及條件
ANI 厭氧菌 ４h；需氧
API20A 厭氧菌 2４h；厭氧
API An-IDENT 厭氧菌 ４h；需氧
API Staph（STAPH－Trac） 葡萄球菌、微球菌 2４h
GPI 革蘭陽性球菌和桿菌 2~15h
ID32 Staph 葡萄球菌 24h
API Coryne(Rapid CORYNE) 棒狀桿菌及相關菌 24h
API 20Strep(Rapid STREP) 鏈球菌、腸球菌 ４~24h
API 20E 腸桿菌科、非發酵菌 2４~48h
EPS (Enteric Pathogen Screen） 愛德華菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、耶爾森菌屬 ４~8h
GNI 腸桿菌科、非發酵菌 2~18h
GNI＋ 腸桿菌科、非發酵菌 2~12h
UID／UID-3 尿液來源尿道致病菌 1~13h
YBC 酵母菌 24~48h
API 20C AUX 酵母菌 48~72h

Crystal Anaerobe 厭氧菌 ４h
Crystal E/NF 腸桿菌科、某些革蘭陰性非發酵菌 18~2４h
Crystal Gram Positive 革蘭陽性球菌和桿菌 18~2４h
Crystal MRSA ID MRSA ４h
Crystal Neisserial/Haemophilus 奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、莫拉菌屬、加德納菌屬、其它的苛養菌 ４h
Crystal Rapid Gram Positive 革蘭陽性球菌和桿菌 ４h

Crystal Rapid stool/Enteric 革蘭陰性腸道致病菌 ３h
Enterotube Ⅱ 腸桿菌科 18~24h
ID Tri-Panel 革蘭陰性和陽性菌 16~20h；40~44h
MiniTek 厭氧菌、腸桿菌科、革蘭陽性菌、奈瑟菌屬、非發酵菌、酵母菌 4h（腸桿菌科、奈瑟菌屬）
72h（酵母菌）

Oxi／FermⅡ 革蘭陰性、氧化酶陽性葡萄糖發酵或不發酵菌
24~48h
NEG ID Type2 腸桿菌科、其它的發酵和非發酵菌 15~42h
Pos ID 革蘭陽性球菌和李斯特菌屬 18~48h
Rapid Anaerobe 厭氧菌 4h；需氧
Rapid HNID 奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、卡他莫拉菌、陰道加德納菌 4h
Rapid NEG ID Type2 腸桿菌科、其他的發酵和非發酵菌 2h
Rapid NEG ID Type3 腸桿菌科、其他的發酵和非發酵菌 2.５h
Rapid Pos ID 革蘭陽性球菌和李斯特菌屬 2h
Rapid Yeast ID 酵母菌 4h

Micro-ID 腸桿菌科 4h
RapID ANAⅡ 厭氧菌 4~6h；需氧
RapID CB Plus 棒狀桿菌 4h
RapID NF Plus 非發酵革蘭陰性桿菌 4h
RapID NH 奈瑟菌、嗜血桿菌和其它革蘭陰性細菌 4h；1h(淋球菌)
RapID onE 腸桿菌科和其它氧化酶陰性菌 4h
RapID STR 鏈球菌 4h
RapID Yeast Plus 酵母菌和酵母菌樣菌 4h

AN 厭氧菌 4~16h；需氧
GN Microplate 需氧革蘭陰性桿菌 4~24h
GP Microplate 大多數革蘭陽性球菌和桿菌 4~24h
YT 酵母菌 24~72h
Neisseria Enzyme test 奈瑟菌屬、莫拉菌屬 30min
r/b Enteric Differential System 腸桿菌科 18~24h
Uni-Yeast Tek 酵母菌 24h~6d
Uni-N/F-Tek 革蘭陰性發酵或不發酵細菌 24~28h
Medical Specialties Inc. Fox Exera GNI 腸道和非腸道革蘭陰性桿菌 18~24h
AccuMed International, Inc. Sensititre AP 80 腸桿菌科和非發酵革蘭陰性桿菌 5~18h

二、自動化的微生物鑒定和藥敏試驗分析系統
自動化的微生物鑒定和藥敏試驗分析系統在臨床微生物實驗室的應用，為微生物檢驗工作者對病原菌的快速診斷和藥敏試驗提供了有力工具。鑒定系統的工作原理因不同的儀器和系統而異。不同的細菌對底物的反應不同是生化反應鑒定細菌的基礎，而試驗結果的準確度取決于鑒定系統配套培養基的制備方法、培養物濃度、孵育條件和結果判定等。大多鑒定系統采用細菌分解底物后反應液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解，測定揮發或不揮發酸，或識別是否生長等方法來分析鑒定細菌。各種微生物鑒定系統的反應基礎見表6-4-4。
藥敏試驗分析系統的基本原理是將抗生素微量稀釋在條孔或條板中，加入菌懸液孵育后放入儀器或在儀器中直接孵育，通過測定細菌生長的濁度，或測定培養基中熒光指示劑的強度或熒光原性物質的水解，觀察細菌的生長情況。在含有抗生素的培養基中，濁度的增加提示細菌生長，根據判斷標準解釋敏感或耐藥。

表 6-4-4 各種微生物鑒定系統的反應基礎

系統源性 需要培養 分析 陽性結果指示 系統舉例
酶譜分析
(通常2~4h) 不需要 酶活性 色原性／熒光性底物混合物被酶水解后產生顏色變化 MicroScan Rapid panels、IDS
pH為基礎的反應
（通常15~24h） 需要 碳水化合物利用 pH指示顏色變化 碳水化合物分解產酸，蛋白質或含氮化合物被水解產堿 API、Crystal、VITEK cards、 Micro Scan conventional panels
碳源利用 需要 有機物 無色變為紫色 Biolog
揮發性和不揮發酸測定 需要 細胞脂肪酸 氣相色譜鑒定終末產物與已知圖譜比較 MIDI
肉眼觀察生長 需要 各種底物 混濁生長 酵母菌鑒定

半自動化細菌鑒定和/或藥敏分析系統
1．VITEK-ATB半自動細菌鑒定和藥敏分析系統
VITEK-ATB是生物-梅里埃公司產品，由計算機和讀數器兩部分組成，計算機程序包括ATB和API的鑒定數據庫、ATB的藥敏數據庫、數據儲存