流式細胞術的發展和臨床應用

流式細胞術(FCM)是70年代初發展起來的一項高新技術，80年代開始從基礎研究發展到臨床醫學研究及疾病的診斷和治療監測。我國在80年代初引進了第一臺流式細胞儀，到目前在醫學院校、科研機構和醫院已經有100多臺。

　　FCM采用流式細胞儀對細胞懸液進行快速分析，通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測，得到該細胞的光散射和熒光指標，分析出其體積、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等物理及化學特征。FCM綜合了光學、電子學、流體力學、細胞化學、生物學、免疫學以及激光和計算機等多門學科和技術，具有檢測速度快、測量指標多、采集數據量大、分析全面、方法靈活等特點，還有對所需細胞進行分選等特殊功能。隨著該儀器性能的不斷完善，操作簡單的各新型流式細胞儀相繼問世。新試劑的不斷發現使試驗費用日益降低，FCM也從研究室逐步進入臨床實驗室，成為常規實驗診斷的重要手段，不僅為臨床提供了重要的診斷依據，也使檢驗科室的診斷水平、實驗技術提高到一個新的高度。

　　一、流式細胞儀工作原理
　　生產流式細胞儀的主要廠家是美國的BD公司和貝克曼庫爾特(BeckmanCoulter)兩家公司，它們生產出一系列科研型和臨床型的流式細胞儀，并研制生產了FCM所用的各種單克隆抗體和熒光試劑。科研型流式細胞儀(如FACStar, FACSort, EPICS-Elite等)功能齊全，分析靈活，但操作比較繁瑣，必須由經過正規培訓的專業技術人員進行操作。臨床型的儀器(FACScan, Profile等)易于操作，穩定性好，分析速度快，適合在臨床實驗室中應用。

　　流式細胞儀的工作原理是將待測細胞經特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細胞柱，后者與入射的激光束垂直相交，液柱中的細胞被激光激發產生熒光。儀器中一系列光學系統(透鏡、光闌、濾片和檢測器等)收集熒光、光散射、光吸收或細胞電阻抗等信號，計算機系統進行收集、儲存、顯示并分析被測定的各種信號，對各種指標做出統計分析［1，2］。

　　科研型流式細胞儀還可以根據所規定的參量把指定的細胞亞群從整個群體中分選出來，以便對它們進行進一步的研究分析。其分選原理是把液滴形成的信號加在壓電晶體上使之產生機械振動，流動室即隨之振動，使液柱斷列成一連串均勻的液滴，一部分液滴中包有細胞，而細胞性質是在進入液滴以前已經被測定了的，如果其特征與被選定要進行分選的細胞特征相符，則儀器在這個被選定的細胞剛形成液滴時給整個液柱充以指定的電荷，使被選定的細胞形成液滴時就帶有特定的電荷，而未被選定細胞形成的細胞液滴和不包含細胞的空白液滴不被充電。帶有電荷的液滴向下落入偏轉板的高壓靜電場時，按照所帶電荷符號向左或向右偏轉，落入指定的收集器內，完成分類收集的目的。對分選出的細胞可以進行培養或其它處理，做更深的研究。

　　二、流式細胞術的臨床應用
　　隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經從科學研究走入了臨床應用階段，在我國臨床醫學領域里已有著廣泛的應用。

　　1.在腫瘤學中的應用：這是FCM在臨床醫學中應用最早的一個領域。首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液，用熒光染料(碘化吡啶PI)染色后對細胞的DNA含量進行分析，將不易區分的群體細胞分成三個亞群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表細胞的倍體狀態，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。(1)發現癌前病變，協助腫瘤早期診斷：人體正常組織發生癌變要經過一個由量變到質變的漫長過程，而癌前細胞即處于量變過程中向癌細胞轉化階段。人體正常的體細胞均具有比較穩定的DNA二倍體含量。當人體發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時，在其發生、發展過程中可伴隨細胞DNA含量的異常改變，FCM可精確定量DNA含量的改變，作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標志，能對癌前病變的性質及發展趨勢作出估價，有助于癌變的早期診斷。有資料證實，癌前病變的癌變發生率與細胞不典型增生程度有密切關系，增生程度越重，癌變發生率越高。隨著細胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍體出現率增高，這是癌變的一個重要標志。(2)在腫瘤的診斷、預后判斷和治療中的作用：FCM在腫瘤診斷中的重要作用已經被認可，DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據，FCM分析病理細胞具有速度快、信息量大，敏感度高等優點，已被用在常規工作中。腫瘤細胞DNA倍體分析對病人預后的判斷有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復發率高、轉移率高、死亡率也高，而二倍體及近二倍體腫瘤的預后則較好。

　　FCM不僅可對惡性腫瘤DNA含量進行分析，還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效，了解細胞動力學變化，對腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫師可以根據細胞周期各時相的分布情況，依據化療藥物對細胞動力學的干擾理論，設計最佳的治療方案，從DNA直方圖直接地看到瘤細胞的殺傷變化，及時選用有效的藥物，對瘤細胞達到最大的殺傷效果。

　　此外FCM近幾年還被應用于細胞凋亡和多藥耐藥基因的研究中［3，4］。醫學工作者開始研究如何用藥物誘導癌細胞死亡。通過對細胞體積、光散射、DNA含量及特異性抗原基因(如bcl-2, Fas等)測定分析出細胞凋亡情況。多藥耐藥是腫瘤病人化療失敗的主要原因，FCM對多藥耐藥基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定，可為臨床治療效果分析提供有力依據。

　　2.在臨床細胞免疫中的作用：FCM通過熒光抗原抗體檢測技術對細胞表面抗原分析，進行細胞分類和亞群分析。這一技術對于人體細胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治療有重要作用。有大量文章介紹了淋巴細胞亞群等在各種疾病中的變化。正常人群淋巴細胞T4/T8比值大約為2∶1，但在人體細胞免疫力低下時可出現比例倒置。用FCM還可以監測腎移植后病人的腎排斥反應，如果T4/T8比例倒置，病人預后良好，較少發生腎排異現象；反之排異危險性增加。同樣此種測定技術也用于愛滋病的診斷和治療中。還有作者報告了外周血淋巴細胞免疫表型的參考值，并對其種族、性別、年齡等影響因素進行了探討［5］。

　　目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經發展到了百余種，可以對各種血細胞和組織細胞的表型進行測定分析。

　　3.在血液病診斷和治療中的應用：FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著舉足輕重的作用。(1)白血病的診斷和治療：FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原(CD)的單克隆抗體，借助于各種熒光染料(異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等)測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病的診斷和鑒別診斷有決定性作用［6］。例如干細胞表達CD34，髓系表達CD13、CD14，B細胞系表達CD10、CD19、CD20等，T細胞系表達CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以測定出血細胞表達各種抗原的水平，協助臨床確診。

　　同其它腫瘤的治療一樣，測定DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。

　　目前臨床除化療藥物治療外還采用造血干細胞移植技術治療急性白血病和一些疑難性疾病［7］。FCM通過對人白細胞抗原(HLA)配型的測定可以為異體干細胞移植病人選擇出最合適的供體。造血干細胞移植技術主要包括干細胞的鑒別、活性測定、干細胞動員和采集、分離純化、保存擴增、腫瘤細胞的凈化、干細胞回輸以及術后保持移植物抗宿主病的低發生率等一系列過程。FCM測定CD34、HLA-DR、CD33等細胞表面標志物，成為干細胞移植技術重要的監測手段。用FCM檢測一系列指標觀察病人的恢復狀態，可以對預后做出早期的判斷。(2)其它種類血液病的診斷和治療監測：陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種造血干細胞克隆病，細胞CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。該抗原屬于血細胞表面磷脂酰肌醇錨連蛋白家族，是重要的補體調節蛋白，它通過與補體C8、C9的結合以阻止補體膜攻擊復合物的形成，從而抑制細胞被補體激活溶解。FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度［8］。(3)網織紅細胞的測定及臨床應用：網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標，FCM通過某些熒光染料(吖啶橙、噻唑橙等)與紅細胞中RNA結合，定量測定網織紅細胞中RNA，得到網織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。有作者報道FCM方法比目測法結果精確度更高［9］。此外FCM還可以測量出網織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義［10］。為干細胞移植術后恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤病人放化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據。

　　4.在血栓與出血性疾病中的應用：(1)血小板功能的測定：正常情況下血小板以分散狀態在血管內運行，但當血管損傷、血流改變或受到化學物質刺激時血小板被活化而發生一系列改變。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷，FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況成為檢查血小板功能的一種新手段［11］。該方法靈敏、特異性高。如果采用全血法測定，只需微量標本，適合于兒童及血小板減少性疾病的患者［12］。

　　血小板活化時其質膜糖蛋白較其靜止期發生顯著改變，FCM可以通過單抗免疫熒光標記(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)監測血小板功能及活化情況，有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療。

　　此外血小板活化時其細胞內的鈣離子濃度發生很大變化，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監測的非免疫性指標。(2)血小板相關抗體的測定：免疫性血小板減少性紫癜病人血漿中可產生血小板自身抗體，結合在血小板表面，稱為血小板相關抗體，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標記被測血小板，FCM可以測定血小板相關抗體含量。直接法檢測血小板表面的相關抗體，間接法可測定血清中的相關抗體。該方法用于該病的診斷及治療監測，具有檢測速度快、靈敏度高的優點。