WesternBlot相關技術操作與原理2

一、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

（一）試劑配制

1．30% 丙烯酰胺（29：1）：

2．1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8

3．1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8

4．10%SDS（室溫保存）:

5．10%過硫酸銨（4℃保存）：

6．TEMED（N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺）：催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰

胺和雙丙烯酰胺的聚合；

7.Tris -甘氨酸電泳緩沖液(1000ml):

8．2×蛋白質電泳上樣緩沖液

9. 蛋白質預染Marker

（二）實驗儀器及耗材

垂直電泳槽

穩壓穩流電泳儀/電轉儀

蛋白變性用加熱儀器

無菌Tip 頭、 Ep 管、碎冰 、注射器等

（三）實驗步驟

1．制備SDS-PAGE 凝膠

（1）準備SDS-PAGE 凝膠用玻璃槽：

將兩條墊片放入兩塊特制玻璃板中間（其中一塊為凹形），用透明膠帶將兩邊及底邊封

嚴。確定灌制分離膠液面標志線（距樣品梳子底部約0.5-25px處）。

（2）配制10%SDS-PAGE 分離膠 (15ml)：

去離子水 5.9ml

30%丙烯酰胺 5.0ml

1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml

10%過硫酸胺 0.15ml

10%SDS 0.15ml

取上述液體1ml, 加入TEMED 3ul, 混勻后用其封凝膠用玻璃槽周邊

（3）灌制分離膠：

待封邊膠凝固后，在其余14ml 分離膠液中加入7 ul TEMED，混合均勻，用吸管輕輕加

入凝膠玻璃槽中，使其液面至標志線位置（避免產生氣泡）。

（4）立即用0.1%SDS 液覆蓋膠面（隔絕空氣,有助于凝膠聚合，使凝膠面形成平直），

室溫放置約40 分鐘至分離膠凝固。

（5）配制5%濃縮膠4ml（此步操作可在配制分離膠時同時進行）：

去離子水 2.7ml

30%丙烯酰胺 0.67ml

1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 0.5ml

10%過硫酸胺（一周內使用） 0.04ml

10%SDS 0.04ml

TEMDE（臨灌膠前再加） 0.004ml

（6）倒掉0.1%SDS 覆蓋液，用去離子水沖洗分離膠表面3-4 次，以洗凈未聚合的丙烯

酰胺凝膠（避免在膠頂部或玻璃夾板中留有氣泡），并用吸水紙吸掉殘留的液體。

（7）將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入5%積層膠液（注意避免產生氣泡），插入樣品

梳，使液面至樣品梳上標志線位置， 室溫凝膠約40 分鐘。

（8）輕輕拔去梳子，撕去封玻璃夾板用透明膠帶，將玻璃夾板“凹”面貼緊電泳槽，

兩側用夾子很好的固定在電泳槽上。用針頭式注射器吸取電泳緩沖液輕輕沖洗點樣孔，以去

除未聚合的凝膠。

2．樣品變性及電泳

（1）由-80℃冰箱取出提取的Hela 細胞總蛋白樣品，立即插入冰中（減少蛋白降解）

待其融化。

（2）吸取細胞總蛋白樣品15ul 加入0.5mlEP 管中, 每樣品管中分別加入5ul 4×蛋白

質凝膠電泳上樣緩沖液, 輕輕混合，98℃變性5 分鐘，立即插入冰中，voltex 數秒，短暫

離心.

（3）吸出變性蛋白液，貼緊加樣孔上方，將樣品輕輕加至凝膠孔中。

（4）將電泳儀設置成穩壓狀態，接通電源，將電壓調至80V 使樣品通過濃縮膠（電壓

約8v/cm）。當染料進入分離膠后，將電壓調高到120V（約12v/cm ),繼續電泳使染料至分

離膠適當位置（4℃冰箱中進行電泳）,結束電泳。