Westernblot標準操作規程(SOP)

關鍵詞：western blot 聚丙烯酰胺 分離膠 積層膠 電泳
目的：蛋白質的檢測與分析
【原理】
一個基因表達終極結果是產生相應的蛋白質（或酶）。因此檢測蛋白質是測定基因表達的主要標志，檢測蛋白質的方法很多，除ELISA法外，也可用與檢測DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸稱為Western（西）印跡法，該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結合的專一性蛋白質。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上并與第一抗體共孵。第一抗體專一地與待分離蛋自質的抗原決定簇結合，然后用另一種蛋自質，如135I-蛋白A或辣根過氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測已結合上去的抗體。本法所需時間6小時或過夜。

蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳
幾乎所有蛋白質電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行，而所用條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結合并因此而帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關。在達到飽和的狀態下，每克多肽約可結合1.4克去污劑，借助已知分子量的標準參照物，則可測算出多肽鏈的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續緩沖系統中進行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強度不同于配膠緩沖液，當兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區帶（或稱積層）。曲于不連續緩沖系統具有把樣品中的復合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。
最廣泛使用的不連續緩沖系統最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)設計的，樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統中所有組分都含有0.1％的SDS(Laemmli, 1970)，樣品和積層膠中的氯離干形成移動界面的先導邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導較低而電位滴度較陡的區域，它推動樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS多肽復合物成一電位和pH值均勻的區帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。

【常用試劑】
1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亞甲丙烯酰胺
將30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。0.45μm微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很強的神經毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺時應戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris?Cl/SDS, pH8.8, 
在300mlH₂O中溶解91g Tris堿(1.5mol/L)，用1mol/L調節pH至8.8, 補加H₂O至體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris?Cl/SDS, pH6.8, 
在40mlH₂O中溶解6.05g Tris堿(0.5mol/L)，用1mol/L調節pH至6.8, 補加H₂O至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
4）4×SDS電泳緩沖液
Tris base 24.2 g
Glycerin 115.3 g
20%SDS 20 ml
加水至總體積1000ml。
應用時稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。
5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合。
6）10%過硫酸銨
過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去離子水配制小量10%(w/v)的貯存液并保存于4℃。由于過硫酸銨會緩慢分解，故應隔周新鮮配制。

【步驟】
1）按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。
2）按表7.1配制分離膠液體并脫氣，然后加入10％的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
表7.1 聚丙烯酰胺分離膠的配制
試劑成分 配制不同濃度分離膠所需試劑(ml)
5% 8% 10% 12% 15%
Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50
4×Tris?Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
H₂O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75
10%過硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5％的凝膠可用于60～200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。
3）用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入于玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少于10μl不需灌制積層膠。
4）用另一根已斯德吸管，先從一邊的墊片，再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。
聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問題在于過硫酸按或TEMED，或兩者都有。
5)傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸干。
6)按表7.2配制積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。
表7.2 聚丙烯酰胺積層膠的配制
GEL%（3.9%) Total (10.05ml)
Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml
4×Tris?Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
H₂O 6.10 ml
10%過硫酸銨 0.05 ml
TEMED 0.01 ml
7)將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩余空間。讓積層膠室溫聚合30min。
8)在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測蛋白質樣品，于100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩沖液溶解之，并同樣在100℃煮沸5-10min。按供應商的使用指南用2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質分子量標準混合物。
對于0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過20μl 為宜。用考馬斯亮藍染色法顯跡，成分很復雜的蛋白質混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。采用銀染顯跡時，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的復雜程度在小于20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。

2×SDS加樣緩沖液(loading buffer)配制：
成　　分 體積 (ml)
0.5M Tris?Cl (pH6.8) 12.5
20%SDS 11.5
Glycerin 10
2% Blue-Bromo-phenol 2.5
β-mercaptoethanol * 5.0
加H₂O至總體積50 ml，分裝
*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。

9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子后，以1×SDS電泳電泳緩沖液沖洗加祥孔，并以此緩沖液充滿之。
10）按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室（上槽），同時往下緩沖液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩沖液。
11）將固定于上槽的凝膠板放入下槽中，并往上槽加入部分電泳緩沖液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。
12）用帶平嘴針頭的50μl注射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴散。
13)再往上槽加入余下的1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。
14）連接電源，對于0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，再將電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止。

15）關閉電源并撤去連接的導線，棄去電泳緩沖液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。
16）將凝膠定位以便識別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來，放在一疊吸水紙或紙巾上。
17）小心將封邊的墊片抽出一半，并以此為杠桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來。
18）小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序，接著就可進行蛋白質的檢測。 

19)轉膜
將凝膠面與負極相連，硝酸纖維素膜與正極相連。（100V，1小時）要放于4℃。
1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH). 
2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH). 
3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS). 
4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations
20)、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。搖床搖動。（這步忘了！）
21)、封閉
1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20). 
2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.
22)、一抗孵育
一抗用TBST1:1000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時，(或4℃過夜)搖床搖動。
Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
23)、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。
24)、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時，搖床搖動。
25)、清洗
同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分鐘，以洗去膜上的Tween 20，因為它可以阻礙底物的沉積。
26)、顯色
按如下配方配制顯色液：
1mL水+1滴（大約50微升）試劑A(之后混勻)+1滴試劑B+1滴試劑C
將硝酸纖維素膜放入其中孵育，一旦顯色，立即放入去離子水中終止反應。

Considerations:
Perhaps the most common problem in western blotting is the occurrence of background staining. The best remedy for high background (in many cases) is simply to dilute the primary antibody further. Other solutions include ensuring that detergent is used in the blocking reagent, using an alternate blocking reagent (casamino acids, BSA, serum), and decreasing the amount of protein applied to the electrophoresis gel.
? Occurrences of extra bands in the blot can be resolved by several strategies. Run a control blot omitting the primary antibody to determine if the secondary antibody is the source of the problem. Replacing the secondary antibody with a different lot or a similar reagent from a different source can provide resolution. Spurious bands below the targeted molecular weight suggest that the protein is being degraded in the experiment; inclusion of protease inhibitors can help.
? No or low signal can be remedied by loading more protein in the gel or increasing the amount of primary and/or secondary antibody applied to the blot.
? Some antibodies will not bind in the presence of detergent; consult the datasheet for each antibody prior to performing any procedure