化學發光測定TSH的實驗評價及其臨床應用

 　作者：王志剛　吳曉燕　畢平安　程巧群

　摘要　用“第三代”化學發光免疫分析“夾心法”，評估化學發光檢測TSH的實驗性能。結果顯示該法精密度：批內與批間CV分別為2.08～2.74%與3.85～4.43%。回收率100.6%，靈敏度0.01 mIU/L，交叉污染率＜0.01%，與RIA法對比試驗Y＝0.8942X+0.2031(r＝0.9867)。因此，化學發光法具高靈敏度和高特異性，使測得的TSH量不但能區分甲減，且能用于診斷甲亢，甚至亞臨床型或潛在型甲狀腺功能亢進或減退。 
　　關鍵詞　化學發光免疫分析　　促甲狀腺激素　　甲亢　　甲減

　　TSH是由垂體前葉S細胞合成與分泌，并受下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調控。該軸失衡導致TSH和甲狀腺激素含量的變化，并出現相應的臨床體癥。常用檢測法中，RIA的靈敏度為1.5 mIU/L，免疫放射法(IRIA)靈敏度為0.1～0.5 mIU/L［1］。現報道應用化學發光免疫分析(CLIA)測定TSH的實驗評價和臨床應用。

材料和方法

　　一、　儀器和試劑　使用Access化學發光分析儀(美國Beckman公司)和CLIA試劑由日本第一化學藥品株式會社提供。RIA法試劑由中國原子能科學研究院提供。通過FMJ全自動γ計數儀測定。 
　　二、　標本　選用疑似有甲狀腺疾患者血清為受檢標本，實驗評價血清為新鮮混合血清或定標血清。 
　　三、　方法　取110 μl血清，加入抗TSH IgG與磁性鐵珠載體結合，再加ALP標記的單克隆抗TSH抗體，37 ℃溫育45 min，用緩沖液洗三次，加入發光劑PPD［4-甲氧基-4-(3-磷酸苯酯)-螺(1，2-二氧雜環丁烷-3，2′-三環癸烷)磷酸鈉］在ALP的作用下，脫去磷酸發射光子，測定其光子量與標準曲線對比。

結　　果

　　一、　線性試驗　取一高濃度血清(S5＝100 mIU/L)稀釋成濃度梯度。線性范圍與相關性試驗表明線性范圍為0.02～80.56 mIU/L，回歸方程：Y＝0.9433X+0.2075，r＝0.9942。 
　　二、　精密度試驗　取1.56，5.62，12.65 mIU/L三份不同濃度的混合血清，各重復測定20次，批內精密度CV值分別為2.74%，2.35%，2.08%。每天一次共10天，批間精密度CV值為4.43%，4.02%，3.82%。 
　　三、　回收率試驗　取兩份混合血清分別進行內加入法，測得回收率分別為100.3%與100.9%，平均100.6%。 
　　四、　靈敏度試驗　將S1＝0.1 mIU/L稀釋成0.01，0.02，0.04 mIU/L，每天測定一次，共20天，測得批間CV值分別為17.62%，16.32%，12.01%，均小于20%。 
　　五、　交叉污染試驗　取S5＝100 mIU/L與S1＝0.1 mIU/L，分別測三次高濃度者(H)后測三次低濃度者(L)，共重復五遍，按［L1-L3）／（H3-L3）］×100%［2，3］算得交叉污染率＜0.01%。 
　　六、　干擾試驗　在TSH濃度為4.0 mIU/L的情況下，hCG,LH,FSH濃度分別在250000 U/L，1000 U/L，1000 U/L，對TSH的測定無明顯干擾［4］。 
　　七、　對比試驗　81份血清標本，分別用CLIA法(Y)與RIA(X)測定TSH進行對比試驗，去除超范圍者，Y＝0.8942X+0.2031，r＝0.9867。臨床CLIA法測定FT3、FT4、TT3、TT4增高的甲亢患者31例，TSH均顯示陽性指標(TSH＜0.53 mIU/L)。 
　　八、　臨床應用　對原發性甲亢，甲減，甲亢藥物治療者及甲亢手術后復查者等共562例，同時測定TT3、TT4、TSH、FT3、FT4五項。TSH值低下者189例(33.6%)，其中168例有甲亢史或臨床癥狀。其他四項均增高97例，TT3、FT3、FT4增高19例，FT3、FT4增高17例。肝硬化患者TSH下降伴FT3、TT3下降3例。對10例單純TSH下降者中，7例為甲亢用藥者，3例在以后的跟蹤復檢中證實為亞臨床或潛在型甲亢。45例(8.0%) TSH值升高，其中18例TT4、FT4下降，6例僅FT4下降，3例其他四項均下降，2例TT3、TT4、FT4下降。按病史分析，原發性甲亢或甲減，TSH的升高或降低與其他甲狀腺激素的升降較有規律。經藥物治療者，不乏有甲亢轉為甲減者。動態觀察發現，經抗甲狀腺藥治療者，各激素的變化程序依次為FT4、TT4、FT3、TT3、TSH。

討　　論

　　CLIA是一種性能頗佳的新方法，其高靈敏度，高精密度，低交叉污染率已達到“第三代”TSH方法學技術指標。用直徑4 μm的磁性包被珠，擴大免疫反應面與底物發光面積，用堿性磷酸酶標記(相當于10－21mol/L的酶)，PPD為底物，其測定靈敏度整體達10－12g水平。本文實驗結果表明測TSH靈敏度＜0.01 mIU/L，而RIA測定TSH靈敏度為1.5 mIU/L，參考值＜12.5 mIU/L，對甲亢無診斷意義。 
　　以CLIA測定TSH，該指標不僅可用于傳統的甲減診斷，而更多地用于診斷甲亢。同時TSH是甲亢病人藥物治療的良好跟蹤指標。臨床應用表明CLIA診斷甲亢的陽性率指標從高到低依次為TSH、FT3、FT4、TT3、TT4。診斷甲減的陽性率指標依次為FT4、TSH、TT4、FT3、TT3。TT4的測定結果易受蛋白含量的影響，FT3、FT4測定需加蛋白分離劑，分離的純度直接影響到極微量FT3、FT4的測定結果，而TSH的測定，運用單克隆抗體，增加了反應的特異性。 
　　總之，用CLIA法測定TSH，不但對甲減，甲亢有明確診斷作用，而且對亞臨床型甲亢，甲減有提示作用，對藥物治療有指導作用，對垂體性疾病或甲狀腺抵抗綜合癥具有協助診斷作用，因而具有極高的臨床應用價值。

參　考文獻

［1］　馮憑.甲狀腺疾病．天津科技翻譯出版社，1995∶32 
［2］　Danier J,Kerry L, Peter G, et al. An improved automated immunochemiluminometric third generation hTSH assay for the ACCESS immunoassay system. Clin Chem, 1996;42∶S170 
［3］　Sadler W, Murray L, Juner J, et al. Influence of specimen carryover on sensitive thyrotropin (TSH) assay: is there a problem.Clin Chem, 1996;42∶593 
［4］　Pilar S, Aurelin Q, Jose M, et al. New immunoelectro-chemiluminometric assay to measure serum thyrotropin. Clin Chem, 1997;43∶2428

王志剛（浙江省嘉興市第二醫院　314000） 吳曉燕（浙江省嘉興市第二醫院　314000） 
畢平安（浙江省嘉興市第二醫院　314000） 程巧群（浙江省嘉興市第二醫院　314000）