國自然最新熱點外泌體，你get到了嗎？

1、  外泌體已成為生命科學/基礎醫學研究一大熱點

2018 年國自然基金評審結果已塵埃落定，其中醫學科學部共計有 9830 項獲得了基金委資助。從數據來看，熱門的幾個方向依然火熱：外泌體、非編碼 RNA、表觀遺傳、腸道菌群、m6A、CRISPR/Cas9 技術等，其中，涉及到外泌體的研究項目 401 項，總資助經費 1.7 億元。哈爾濱醫科大學李悅教授「外泌體 miRNAs 介導細胞間應答網絡調控心房代謝重構在心房顫動中的作用與機制」獲得了重點項目資助。外泌體中標項目呈逐年增長的態勢，其炙手可熱的程度從科學網的統計數據可見一斑。

1）近 10 年外泌體相關基金項目年度中標量

2）近 5 年外泌體相關基金項目年度中標金額

2、何為外泌體，外泌體的生物學功能

外泌體是多泡體限制性膜與細胞質膜融合而釋放的脂質雙層膜囊泡，直徑約 30～200 nm，電子顯微鏡下呈雙凹碟形或杯狀，外泌體能夠運載其內源性的蛋白質、脂質、核酸、miRNA 等信息物質參與細胞間通訊和機體的生理代謝過程，被認為是細胞間通訊、疾病診斷和預后循環生物標志物的重要載體，在臨床診斷和治療方面展現出了極具前景的研究價值。外泌體通過其攜帶的蛋白質、核酸、脂類等來調節受體細胞的生物學活性，從而參與機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等生物學過程。外泌體的研究方向包括基礎機制研究及臨床應用研究，涉及腫瘤、免疫、代謝、神經調控等多個領域（參見以下外泌體學科中標情況）。

1）外泌體中標項目學科分布情況

3、  外泌體富集分離、鑒定、內容物分析

外泌體含多種蛋白，包括膜蛋白如 Tetraspanins 家族 CD9、CD63、CD81；細胞質蛋白如 Alix, TSG101, annexins, Rabs; 細胞骨架蛋白如 acins, myosins, tubulins; 分子伴侶如熱休克蛋白（HSPs）；代謝酶如 enolases, GAPDH; 以及核糖體蛋白等。外泌體內還能包裹 mRNA、miRNA、lncRNA、mtDNA、circRNA 等核酸物質。外泌體所包裹的內容物具有細胞類型特異性，可轉移至受體細胞并發揮生物學作用。

外泌體富集分離：外泌體在大小、來源和分子內容物方面均存在高度異質性，因此富集分離外泌體是開展其基礎研究和臨床轉化應用的前提。傳統經典的富集分離外泌體的方法有：超速離心、密度梯度離心、共沉淀、分子排阻色譜、不對稱流場分離技術等。為了改進分離效率和特異性，新的方法也層出不窮，包括：微流體過濾、無接觸分選、免疫親和富集等。

基于物理特性鑒定外泌體的方法有：顯微鏡技術包括掃描電鏡技術（SEM）、透射電鏡技術（TEM）、冷凍電鏡 (cryo-EM)、原子力顯微鏡（AFM）；動態光散射 (DLS)；納米顆粒示蹤分析 (NTA)；可調電阻脈沖傳感 (TRPS)；以及單一 EV 分析法 (SEA)

外泌體顯微成像. a) SEM；b) TEM; c) cryo-EM; d) AFM from Shao, H., et al. 2018. Chem Rev.

外泌體相關蛋白鑒定：外泌體蛋白的鑒定和定量不僅有利于鑒定外泌體的來源及其內容物、而且對于外泌體生理病理標志物的鑒定也非常重要。傳統的方法包括 WB、ELISA、質譜；這些年針對外泌體的研究也出現了一些新方法，包括小顆粒流式細胞儀、微核磁共振、Nanoplasmonic Exosome (nPLEX) Sensor、Integrated Magnetic-Electrochemical Exosome(iMEX) Sensor、和 ExoScreen。

WB 和 ELISA 鑒定外泌體蛋白. a) WB； b)  ELISA from Shao, H., et al. 2018. Chem Rev.

外泌體攜帶大量的 RNA 和 DNA，RNA 是主要形式，通常為非編碼 RNA，包括 miRNA, tRNA, lnRNA, 碎片化的 mRNA 等。越來越多的研究表明，這些 RNA 被外泌體遞送到受體細胞并發揮功能活性，因此，外泌體 RNA 在細胞間通訊、疾病診斷和預后循環生物標志物領域都得到了極大關注，此外，外泌體作為 RNA 藥物遞送體系也具有重要的臨床應用價值，得到越來越多的研究。

外泌體核酸抽提流程 from Shao, H., et al. 2018. Chem Rev.

4、 外泌體研究文獻解讀

這篇文章來自浙江大學張龍教授團隊 2018 年 3 月發表于 Nature Immunology，揭示腫瘤外泌體在宿主固有免疫失衡中的重要作用，并闡明了關鍵分子機制。

研究人員首先發現腫瘤細胞來源外泌體（tumor-derived exosomes, TEXs）抑制宿主固有免疫反應。

然后通過藥物篩選和質譜鑒定技術，發現 TEXs 抑制宿主固有免疫的重要組分為 EGFR

通過激酶組的篩查發現巨噬細胞 MEKK2 是 TEXs 遞送 EGFR 的靶點，且依賴其 K385 激酶活性。

基因敲除小鼠模型顯示 MEKK2 為 TEXs 抑制固有免疫所必需

研究人員通過報告基因分析和免疫共沉淀等技術進行深入的機制研究，發現 MEKK2 與 IRF3 相互作用，通過磷酸化 IRF3 Ser173，并促進 IRF3 的多泛素化修飾，從而抑制其轉錄活性。

在這篇文章中，研究人員建立了體外和體內實驗模型，發現惡性腫瘤細胞往往能夠通過分泌大量外泌體抑制宿主固有免疫。進一步通過體外外泌體的大量獲取和質譜研究，研究人員證實惡性腫瘤細胞來源外泌體含有并能傳遞 EGFR 到宿主巨噬細胞并抑制一型干擾素的產生。 TEX 來源的 EGFR 能引起 MEKK2 活化、促進 IRF3 Ser173 發生磷酸化以及 Lys77 發生 K33-鏈泛素化，從而破壞 IRF3 的核定位，進而抑制其轉錄活性和一型干擾素的產生。該研究結果不僅發現了腫瘤細胞如何破壞宿主天然免疫，在一定程度上揭示了腫瘤病人免疫力下降的部分原因，也為外泌體的功能解析提供了新的方法和新的探索方向。