同步輻射技術助力MALDI質譜基質電離的作用機制分析

　　A． 抗生素檢測

　　在全球范圍內，人們越來越擔憂抗生素的不當使用不僅會污染環境，還導致食品受到污染，甚至威脅到公共衛生的醫療實踐。由于抗生素的過量使用，各種“超級細菌”相繼出現，已經成為人類健康的致命威脅。因此需要開發更快速且靈敏的技術來檢測微量的各種抗生素來滿足不斷增長的需求。傳統檢測方法包括微生物生長抑制試驗，色譜法，免疫化學檢測，以及基于受體或酶的試驗。但是，這些方法仍存在著一些缺陷，如低靈敏度、樣品預處理步驟復雜、受酶活性波動影響等缺點。

　　B． MALDI-TOF-MS技術優勢和缺陷

　　基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）是分析生物分子不可或缺的工具，具有高靈敏度、高通量和快速的優點。然而，在MALDI-TOF MS中廣泛使用的傳統有機基質（CHCA，DHB，SA等）由于在激光照射下自身產生許多結構碎片，使其在質荷比低于700時具有強烈的背景噪聲。這些背景噪聲抑制了小分子分析物的信號，因此嚴重限制了MALDI-TOF MS在m / z<700分子范圍內的應用。

　　C． 研究的出發點

　　在最近的研究報道中，各種無機納米材料或無機納米結構表面已經被提出作為合適的基質應用在MALDI里替代有機基質，包括硅，金屬，金屬氧化物和碳基納米材料。在選擇無機納米材料做基質時，較大的比表面積、良好的光吸收能力和電子轉移能力是重要的參考條件。本文作者曾報道過，CuCoO-GO材料具有很好的光電性能，在氨硼氮水解過程中提高了電子轉移能力從而起到協同催化作用。而此前氧化石墨烯（GO）也被報道其本身有較大的表面積和良好的光吸收性，具有做基質的潛力。因此，本文作者（蘇州大學FUNSOM研究院劉堅教授課題組和鐘俊教授課題組）就想到把CuCoO-GO復合材料應用到MALDI中做基質，希望能利用這些特性協同促進MALDI中小分子的電離能力從而提高質譜信號。

　　另一方面，將無機納米材料作為MALDI基質雖然在文獻上已有不少的報道，但是對于這類材料是如何促進目標分析物解吸附電離的機制并不清楚。本文作者希望能夠充分利用同步輻射技術追蹤材料組成元素價態變化的能力，研究MALDI基質在輔助增強分析物激光解析電離過程中的機理，探究其基質與目標分子的相互作用以及所伴隨的電荷偏移過程。通過原位實驗了解CuCoO-GO與分析物在激光照射前后價態的變化，在原子層面推測其相互作用的信息，探究增強其效率的影響因素。首次利用同步輻射技術嘗試對MALDI質譜基質增強分析物解析電離的作用機制進行解釋是該工作的亮點。

　　材料的表征與質譜性能

　　CuCoO-GO用SEM，TEM，AFM，XRD，Raman等做了表征，主要證明了CuCoO-GO的尺寸大小和厚度以及材料的均一性(Fig. 1)。

　　Fig. 1 Characterization of CuCoO-GO (CuO-GO and GO as the control samples. (a) TEM image； (a1) Dark-field TEM image； (a2) Zoomed-in view of dark-field in the red box； (a3-a4) Corresponding elemental mapping in the red box: Cu (green) and Co (brown). Sample: CuCoO-GO； scale bars as specified. (b) AFM image of CuCoO-Go in the larger field of view； (b1) AFM of a single nanosheet of CuCoO-Go； (b2) Height profile correspondingly along the blue line of (b1). scale bars: 5 μm. (c-d) Raman spectra and X-ray diffraction (XRD) patterns of GO, CuO-GO and CuCoO-GO.

　　在探究CuCoO-GO的質譜性能時，本文作者在相同的儀器條件下，比較了CuCoO-GO基質與傳統的有機基質CHCA和SA的背景噪聲。如Fig. 2a所示，有機基質（CHCA或SA）在低分子量范圍（m / z<700）內產生強烈的背景噪聲。相比之下，CuCoO-GO的背景很干凈，這證明了CuCoO-GO作為MALDI基質檢測m / z <700范圍內的小分子具有良好的潛力。接著本文作者選擇小分子抗生素磺胺嘧啶（SDZ）和磺胺甲惡唑（SMX）為分析物，分別在正離子和負離子模式下進行MALDI 質譜檢測。如圖2b所示，在任何一種模式中，分析物都有明顯的特征峰和較高的信噪比。本文作者通過實驗證明該方法的檢測極限可達ug/L級別，比之前文獻報道值低幾百倍。同時，本文作者用同位素標記的方法對磺胺嘧啶進行了定量檢測，定量結果表明，無論在水中或牛奶溶液中都具有良好的線性關系，表明該方法可應用于牛奶樣品中殘留抗生素定量分析。

　　Fig. 2 High performance of CuCoO-GO matrix in MALDI mass spectrometry for antibiotic analysis. (a) The background noise of CuCoO-GO matrix in comparison with traditional organic matrices of CHCA and SA, in the negative-ion mode. (b) The mass spectra of SDZ and SMX in the positive-ion and negative-ion modes using CuCoO-GO matrix. (c) Mass spectra of SDZ and sulfapyridine-13C (internal standard) in the water solution or the milk sample, and the calibration curves for absolute quantitation of SDZ in the negative-ion mode (n=4). Error bar: standard deviation.

　　基于磺胺嘧啶分子的高靈敏定量檢測，本文作者進一步將CuCoO-GO基質應用于抗菌藥物耐藥性分析上。通過MALDI質譜同位素標記的方法定量分析大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在與磺胺嘧啶共孵育后的細菌外部和內部的藥物濃度，可為研究細菌耐藥機制提供重要的線索。

　　MALDI質譜的機理解釋

　　本文作者利用同步輻射技術進行原位表征，探究CuCoO-GO基質在有無小分子分析物時的特定元素吸收變化。如下圖所示，CuO-GO在添加了分析物前后與沒有發生明顯的變化，而CuCoO-GO在添加了檢測物后Cu原子的 L-edge吸收峰位發生了右移。這種變化可歸因于SDZ與Cu元素之間的相互作用，其誘導SDZ中部分電子從Cu轉移到O的效應。在原位Cu K-edge 吸收測量實驗中，也得到支持上訴結果的實驗數據，并進一步研究了UV光照射前后對CuCoO-GO/檢測物體系的Cu K-edge 吸收變化的影響。

　　Fig. 5 Investigation of the interactions between the SDZ and CuCoO-GO by synchrotron radiation-based techniques.

　　基于上述實驗證據，本文作者提出了一種基于CuCoO-GO基質的小分子電離機理（見示意圖）。CuCoO-GO復合納米材料能夠在GO納米片層上形成的Cu，Co，O原子團簇輔助高效電離小分子分析物（SDZ）。 SDZ分子可以通過氫鍵和范德華力等在CuCoO-GO的表面上發生較強的吸附。基質上的Cu和O原子有可能分別與SDZ分子中的S = O鍵和-NH-基團有相互作用。Co作為基質中原子團簇的摻雜元素（雖然很少量）使其整體與GO之間的相互作用增強，促進CuCoO-GO雜化基質與SDZ在電離過程中的電荷轉移。通過激光可以為SDZ的去質子化（SDZ-H) -提供必要的能量，并且被MALTI-TOF MS中的質量分析器檢測。雜化CuCoO-GO納米片層材料由于其離域π電子系統能夠促進該去質子化過程。由于Co和Cu雙金屬氧化物在GO納米片層上的協同效應，該復合材料基質可以提高小分子的電離效率，從而提高它們在質譜中的信噪比。

　　Fig. 6 Schematic diagram of the mechanism of SDZ ionization using CuCoO-GO matrix for MALDI TOF mass spectrometry.

　　結論

　　本文開發了一種復合納米材料CuCoO-GO作為新型的MALDI基質，并揭示了分析物與納米材料相互作用的電離機理。與文獻報道相比，CuCoO-GO基質可以檢測各種抗生素，且檢測極限改善數百倍。與此同時，該方法重復性好，并且能有效定量分析牛奶樣品中磺胺類藥物的量。此外，本文開發的方法可以提供抗菌藥物的細菌內外濃度的定量分析，以及常規AST方法難以獲得的潛在代謝物；并期望CuCoO-GO基質能夠靈敏地檢測含有羧基，胺，酰胺，羰基，磺酸基和羥基等官能團的各種生物分子。通過利用同步輻射技術，本文作者研究了磺胺嘧啶分子與CuCoO-GO基質之間的相互作用的電離機理，這種對基質/分子相互作用和電離機制的關鍵理解可能為新基質的開發和小分子的超靈敏檢測增加創造性的知識。