瓊脂糖凝膠中DNA的回收（DEAE纖維素膜電泳）

發布時間：2019-09-10 09:08 原文鏈接：瓊脂糖凝膠中DNA的回收（DEAE纖維素膜電泳）

實驗方法原理	從瓊脂糖凝膠回收 DNA 是通過電泳至帶正電荷的 DEAE-纖維素膜上完成的。這種方法首先利用適當濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段，然后緊靠目的 DNA 片段條帶前方切一裂縫。將一長條 DEAE 纖維素膜插入裂縫。
實驗材料	限制性內切核酸酶 DNA 樣品 DNA 標準 RNA
試劑、試劑盒	乙酸銨 DEAE 高鹽洗脫緩沖液 DEAE 低鹽洗脫緩沖液 EDTA 乙醇凝膠載樣緩沖液 NaOH 酚氯仿醋酸鈉 TE
儀器、耗材	瓊脂糖凝膠 DEAE 纖維素膜手提式長波紫外燈水浴
實驗步驟	一、材料 1. 緩沖液和溶液乙酸銨（10 mol/L) DEAE 高鹽洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1 mol/L NaCI，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)） DEAE 低鹽洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，0.15 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)） EDTA ( 10 mmol/L，pH 8.0) 乙醇 6X 凝膠載樣緩沖液 0.5 mol/L NaOH 酚: 氯仿（1:1，V/V) 醋酸鈉（3 mol/L，pH 5.2) TE ( pH 8.0) 2. 酶和緩沖液限制性內切核酸酶 3. 凝膠瓊脂糖凝膠，含有 0.5 ug/ml 的 EB 4. 核酸和寡聚核苷酸 DNA 樣品 DNA 標準 RNA，酵母轉運 tRNA 5. 專用設備 DEAE 纖維素膜手提式長波紫外燈 65℃ 水浴二、方法 1. 消化一定量 DNA 以收獲至少 100 ng 目的片段 DNA。用含有 0.5 ug/ml EB 的適當濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段。用手提式長波紫外燈對目的條帶進行定位。 2. 用鋒利的刀片或剃刀在緊靠目的條帶前的凝膠上切一切口，其兩邊比條帶寬約 2 mm。 3. 戴上手套，切一塊與切口等寬而比凝膠稍深（1 mm ) 的 DEAE 纖維素膜。在 10 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 室溫浸泡 5 min 后，用 0.5 mol/L NaOH 取代 EDTA 浸泡以活化 DEAE 纖維素膜。再次室溫 5 min 后，用無菌水沖洗 6 次。 4. 用平頭鑷子將切口壁撐開，將膜插入裂縫中。取出鑷子，使切口閉合，小心勿留氣泡。 5. 繼續電泳（<5 V/cm) 直至 DNA 條帶遷移到膜上。電泳過程中，可以用手提式長波紫外燈（302 nm ) 進行跟蹤檢測。 6. 當所有目的 DNA 離開凝膠被收集到膜上時，切斷電流。用平頭鑷子從凝膠中取出膜，室溫下，用 5~10 ml DEAE 低鹽緩沖液將膜漂洗一下，以除去膜上的瓊脂糖。 7. 將膜轉移到另一個微量離心管中，加足量的 DEAE 高鹽洗脫緩沖液使膜完全被浸沒。輕輕的將膜弄皺或對折，但不要壓緊。蓋上離心管蓋，于 65℃ 溫育 30 min。 8. 從膜上洗脫 DNA 的過程中，對凝膠成像，記錄被分離出的條帶。 9. 步驟 7 的液體轉移到另一微量離心管，再加入足量的 DEAE 高鹽洗脫緩沖液，于 65℃ 溫育 15 min。合并兩份 DEAE 高鹽溶液。 10. 高鹽洗脫液用酚：氯仿抽提一次。水相轉移到另一離心管。加入 0.2 倍體積的 10 mol/L 乙酸銨，2 倍體積的 4℃ 乙醇。室溫放置 10 min。用微量離心機室溫以最大轉速離心 10 min。用 70% 乙醇小心洗沉淀。打開離心管幾分鐘，使乙醇完全揮發。再將 DNA 重溶到 3~5 ul TE (pH 8.0)。 11. 如果需要極純的 DNA ( 如用于小鼠受精卵的顯微注射或培養細胞電穿孔)，可以按照下述方法用乙醇再沉淀 DNA。 (1) 用 200 ul TE（pH 8.0）懸浮 DNA，加入 25 ul 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2），用 2 倍體積的乙醇重新沉淀 DNA。 (2) 4℃ 微量離心機最大速度離心 5~15 min, 回收 DNA。 (3) 70% 乙醇小心漂洗沉淀。打開離心管幾分鐘，使乙醇完全揮發。將 DNA 溶于 3~5 ul TE ( pH 8.0)。 12. 通過凝膠電泳對 DNA 進行定性和定量。將少量（10~50 ng) 最終制備的 DNA 片段與 10 ul TE ( pH 8.0) 混合，加入 2 ul 所需的凝膠載樣緩沖液。加樣并在適當濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳，以已知量的經用適當限制酶消化的原 DNA 作為參照物標準和分子質量標準。分離的片段應該與限制酶消化產物中的相應片段同步遷移。仔細檢査凝膠，看是否有弱熒光帶存在。弱熒光帶存在表明有 DNA 污染。展開
注意事項	1.切膠回收時切下來的部分盡量小，以提高回收效率。 2.在接觸到紫外線照射時，應做好保護措施。
其他	材料 1. 緩沖液和溶液乙酸銨（10 mol/L) DEAE 高鹽洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1 mol/L NaCI，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)） DEAE 低鹽洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，0.15 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)） EDTA ( 10 mmol/L，pH 8.0) 乙醇 6X 凝膠載樣緩沖液 0.5 mol/L NaOH 酚: 氯仿（1:1，V/V) 醋酸鈉（3 mol/L，pH 5.2) TE ( pH 8.0) 2. 酶和緩沖液限制性內切核酸酶 3. 凝膠瓊脂糖凝膠，含有 0.5 ug/ml 的 EB 4. 核酸和寡聚核苷酸 DNA 樣品 DNA 標準 RNA，酵母轉運 tRNA 5. 專用設備 DEAE 纖維素膜手提式長波紫外燈 65℃ 水浴來源《分子克隆實驗指南第三版》黃培堂等譯。展開

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