| 實驗步驟 |
階段 1:pTet-tTAK 穩定轉染成纖維細胞
材料
緩沖液和溶液
貯存液稀釋到適當濃度。
CaCl2(2mol/L)
溶液過濾除菌，然后以毎份 5 ml 分裝，貯存在-20°C。
小牛血清（10%)
氯喹（10 mg/ml)
可選，請見步驟 7。
氯喹溶于水，溶液過濾除然后貯存在-20°C 。
10 mg/ml 氯喹相當于 19 mmol/L。請見第 16 章信息欄的二磷酸氯喹部分。
甘油（15%)HEPES 緩沖液稀釋
HEPES 緩沖液
磷酸緩沖液
酶和緩沖液
合適的限制性內切酶
請見步驟 2。
1X 胰酶-EDTA
0.05% 胰酶
0.5 mmol/LEDTA(PH8.0)
培養液
DMEM 完全培養液（Dulbecco's modified Eagle's medium complete)
DMEM
100 單位/ml 靑霉素
100ug/ml 鏈霉素
2 mmol/L 谷氨酰胺
10% 供體小牛血淸
含有 0.5 噸/ml 四環素-HCl 的 DMEM 完全培養液
四環素-HCl 溶于 70% 乙醇，濃度 10 mg/ml, 貯存于-20°C。本方案中使用的含有 0.5ug/ml 四環素-HCl 的 DMEM 完全培養液 (含有或不含有選擇性試劑）在 4°C 可以避光保存太約 1 個月。
含有 L-組氨醇（L-histidind) 和 0.5ug/ml 四環素的選擇培養液
不含組氨酸的 DMEM
100 單位/ml 青霉素
100ug/ml 鏈霉素
2 mmol/L 谷氧酰胺
10% 供體小牛血清
125,250 或 500umol/L L-組氨醇（準備 125 mmol/L 貯液，在-20°C 貯存)
0.5ug/ml 四環素-HCl(溶于 70% 乙醇，濃度 10mg/ml, 在-20°C 貯存）
Irvine Scientific 公司（Santa Ana,California) 出售不含組氨酸的 DMEM。含有 0.5ug/ml 四環素-HCl 的選擇培養液在 4°C 可以進光保存大約 1 個月。
特殊設備
塑料克隆環
克隆環豎放在一薄層真空脂上高壓滅菌。
聚丙乙烯管（4 ml)
組織培養皿（6 cm 和10cm)
這些方案可以縮小規模，那樣需要的細胞少，使用的培養皿和培養板部小一些，并且所有組分按比例減少。
附加試劑
步驟 23 需要列在第 7 章方案 8 或附錄 8 中的試劑。
載體和菌株
pSV2-His
質粒都用 CaCl-溴化乙錠梯度平衡離心（第 1 章方案 10）或層析柱純化（第 1 章方案 9）。
關于
pSV2-Hia 的信息，請見 Damke 等（1995)。質粒 pTet-tTAk 和 pTet-Splice 在 Life
Technologies 公司有售，其他帶有選擇標記的載體也有出售（如 Promege 公司有 pCI-neo，CLONTECH 公司有
pTK.HYG)。如果以其他載體代替 pSV2-His，要用適合該質粒所帶選擇標記的選擇培養液。
帶有靶基因開放閱讀框的 pTet-Splice
可選，請見步驟 2。
pTet-tTAk
細胞和組織
培養的哺乳動物細胞
本方案使用 NIH-3T3 細胞，但其他細胞當然也能用。細胞在合適的培養液中生長。
方法
培養和轉染細胞
1. 在 DMEM 完全培養液中培養貼壁細胞。轉染前一天，把細胞換到含有 0.5ug/ml 四環素-HCl(四環素）的 DMEM 完全培養液中。每個 10 cm 培養皿中加入足量細胞, 使轉染那天，細胞可以有 33% 的匯合度。
重要：從這時起除非特別說明，細胞都在 37°C，5%CO2，含有 0.5ug/ml 四環素-HCl 的培養液中培養。
2.
在合適的限制性內切酶位點使質粒線性化，并把每種質粒的濃度調整為≥0.5 mg/ml。10~20ug 質粒 pTet-tTAk 和 1~2ug
pSV2-His(Tet 質粒與帶選擇標記的質粒的摩爾比大約為 10:1) 與 500ul HEPES 緩沖液在一個干凈的 4 ml
聚丙乙烯管中混合。
如果要共轉染靶基因，那么帶有靶基因的 pTet-Splice 重組體的加入量與 pTet-tTAk 的摩爾數相等。
3.DNA 混合物中加人 32.5ul 2mol/L CaCl2。立即輕輕振蕩使溶液混勻。溶液在室溫保存，不時地混勻。15~30 min 后會形成絮狀沉淀。
用磷酸鈣轉染細胞的更詳細內容請見第 16 章方案 2 和 3。
4. 吸掉步驟 1 準備的細胞培養皿中的所有培養液。
5. 用巴斯德吸管混合 CaCl2-DNA 若干次。滴加混合物，使它均勻地蓋在單層細胞上。
6. 細胞在 37°C，5%CO2 條件下培養 30 min,15 min 后搖動培養皿，保證 DNA 沉淀物的均勻覆蓋。
7. 每個細胞培養皿中加入 10 ml 含有四環素的 DMEM 完全培養液。細胞在 37°C，5%CO2 條件下培養 4~5 h。
如果細抱可以耐受，這時可以加入終濃度為 25umol/L 的不同類型細胞的最佳轉染培養時間會有變化。
8. 輕輕吸掉培養液。避免破壞細胞上的沉淀物。
9. 加 2.5 ml 含 15% 甘油而且預熱到 37°C 的 HEPES 緩沖液進行甘油休克。細胞在室溫放置 2.5 min。甘油是滴加到培養液中。
甘油休克后，細胞看上去有些碎碎的是正常的。使用氯喹（步驟 7) 會進一步減低細胞的完整程度，但會提高轉染效率。
10. 恰好在 2.5 min 的時候吸掉甘油溶液。操作得快一點，因為甘油對細胞毒性很大。
對于某些恢復能力強的細胞類型，為了優化轉染效率，細胞在甘油溶液中的時間可以提高到 4~5 min。
作為一般規則，細胞休克的最長時間應該允許有大約 50% 的細胞存活。
11. 立即又輕又快地加入 10 ml 含有四環素的 DMEM 完全培養液洗細胞。立即吸掉培養液，再重復洗滌。
重要：因為甘油休充后，細胞很容易從培養皿上脫落下來，所以培養液都要在一個位置加。
12. 細胞中加入 10 ml 含有四環素的 DMEM 完全培養液，37°C 培養過夜。
13. 轉染后大約 16~24 h, 吸掉培養液，換上 10 ml 含有四環素的 DMEM 完全培養液。
轉染后一共在 37°C 培養 48 h(即步驟 12 和 13 的總培養時間）。
轉染細胞的篩選和克隆
14. 轉染后 48 h, 細胞用幾種稀釋度分到含有 125umol/L 組氨醇和 0.5ug/ml 四環素-HCl 的培養液中。細胞密度為每個 10 cm 培養皿大約 1X106 到 3X104。含有大約 1X105 細胞的培養皿需要培養若干個。
15. 細胞在選擇培養液中培養 4 天后，接著用 3~4 ml 含有 125umol/L 組氨醇和 0.5ug/ml 四環素-HCl 的選擇培養液培養。
16. 集落形成后（通常經過大約 10~12 天選擇培養)，換成含有 250umol/L L-組氨醇和 0.5ug/ml 四環素-HCl 的選擇培養液。
L-組氨醇通常對細胞有毒。所以只有當 pSV2-His 有高水平表達的細胞量達到曲界值，才能提髙選擇培養液中 L-組氨醇濃度
17. 集落長好以后（選擇培養 12~15 天)，在培養皿的底部用圓畫出每個集落的邊界。吸掉培養液，在培養皿的單個克隆上放置無菌的塑料克隆環。每個挑選的集落重復這個步驟。從培養皿中挑選細胞，要求單個集落隔得比較開，而且易于分辨。
重要: 用 pTet-tTAk 穩定轉染后，為了防止 tTA 表達及隨后篩選髙表達 tTA 的克隆時的毒性作用，細胞必須在含有 0.5ug/ml 四環素的培養液中培養。
18.
用大約 100ul 磷酸緩沖液很快地洗克隆。為了使細胞脫落，加 2 滴 1X 胰酶-EDTA(~100ul) 并放置
30~60s。用巴斯德吸管上下吹打使細胞變松。每個集落轉移到 24 孔組織培養板的一個孔中，每個孔中有 1 ml 含 250umol/LL
組氨醇和四環素的選擇培養液。
隨后的細胞傳代都用標準方法，如（1）PBS 快速洗滌；（2）1~3 min 胰酶-EDTA 消化（毎個鋪滿細胞的 10 cm 培養皿加 2 ml);（3）用含四環素的選擇培養液或 10% 小牛血淸稀釋/終止胰酶的活性。
19. 當孔中的細胞長到 80% 匯合度，把它們轉移到 6 cm 組織培養皿中，用含有 500umol/L L-組氨醇和四環素的選擇培養液培養。
NIH-3T3 細胞可以在大約 4~7 天生長到 80% 匯合度；但是不同細胞系甚至不同克隆生長到 80% 匯合度所需的時間是不同的。
20. 細胞在含有 500umol/L L-組氨醇和四環素的選擇培養液中擴大培養（通常細胞進行 1:5 到 1:10 稀釋）。
細胞進行蛋白誘導表達測試
21. 當單層細胞再次生長到大約 80% 匯合度，每個細胞克隆收集一部分，在液氮中凍存。余下的細胞進行傳代培養，直到數量足夠用于測試蛋白的誘導表達。
以后使用凍存細胞的時候, 需要復蘇，然后在含有 500umol/L L-組氨醇和 0.5ug/ml 四環素-HCl 但不含組氨酸的 DMEM 培養液中培養。
22. 如果細胞用 tTA 和靶質粒共轉染，可以如階段 3 所述直接分析靶基因的產物。如果細胞只用 pTet-tTAk 質粒轉染，如下進行細胞的誘導表達測試：
a. 誘導前一天，細胞以適當的密度在含有 500umol/L L-組氨醇和 0.5ug/ml 四環素-HCl 的 DMEM 培養液中培養，使它們在收獲時可以達到亞匯合態。
b. 第二天，用 PBS 洗細胞 3 次，每次都要輕輕旋轉培養板。
c. 第三次洗滌后，立即加入含有 500umol/LL-組氨醇但不含四環素的選擇培養液。細胞在含或不含四環素的培養液中培養 6~48 h。
23. 通過 Northern 分析或免疫印跡法測試細胞中 tTA 的誘導表達。然后如階段 2 所述，用靶質粒轉染表達 tTA 的細胞系。
穩定轉染的 NIH-3T3 細胞中，通常誘導 6 h 后可以觀察到 tTA 和靶基因的表達，再過 6 h 后，表達量達到最大值。
階段 2: 四環素調控的靶基因穩定轉染可誘導表達 tTA 的 NIH-3T3 細胞
材料
緩沖液和溶液
小 牛 血 清（ 10%)
HEPES 緩沖液
磷酸緩沖液
酶和緩沖液
合適的限制性內切酶
1X 胰酶-EDTA
0.05% 胰酶
0.5 mmol/LEDTA(pH8.0)
培養液
含有 500umol/L-組氨醇和 0.5ug/ml 四環素的選擇培養液（含或不含 3ug/ml 嘌呤霉素）
不含組氰酸的 DMEM
100 單位/ml 靑霉素
100ug/ml 鏈霉素
2 mmol/L 谷氨酰胺
10% 小牛血清
500umol/LL-組氨醇（由 125 mmol/L 貯液稀釋，在-20°C 貯存）
0.5ug/ml 四環素-HC1(溶于 70% 乙醇，濃度 10mg/ml, 貯存于-20°C。）
Irvine Scientific 公司（Santa Ana，Califomia）出售不含組氨酸的 DMEM。含有 0.5ug/ml 四環素-HCl的選擇培養液在 4°C 可以避光保存大約 1 個月。
適當的時候加 3ug/ml 嘌呤霉素。
特殊設備
塑料克隆環
克隆環豎放在一薄層其空脂上離壓滅菌
聚丙乙烯管（4 ml)
組織培養皿（6 cm 和 10 cm)
組織培養板（24 孔）
附加試劑
本階段步驟 3 需要列在本方案階段 1 中的試劑。
載體和菌株
pPGKPuro(或帶有其他選擇標記的載體）
所有質粒都用 CaCl-液化乙錠梯度平衡離心（第 1 章方案 10）或層析柱純化（第 1 章方案 9)。
關于選擇標記的信息，請見
Damke 等（1995)。質粒 pTet-Splice 和 PUHC13-3 在 Life Technologies
公司有售。其他帶有選擇標記的載體也有出售（如 Piomega 公司有 pCI-neo,CLONTECH 公司有 pTK-HVG 或
pPUR)。如果以其他載體代替 pPGKPuro, 就用適合該質粒所帶選擇標記的選擇培養液。
帶有報道基因的 pTet-Spliqe(可選，如 PUHC13-3)
帶有靶基因開放閱讀框的 pTet-Splice
細胞和組織
可誘導表達自調控 tTA 的穩定細胞系 （階段 1)
方法
培養和轉染細胞
1.
在含有 500umol/LL-組氨醇和 0.5ug/ml 四環素-HCl 的完全選擇培養液中培養可以誘導表達自身調控的 tTA
的穩定細胞系（階段 1 中分離得到)。轉染前一天，把細胞傳代到含有完全選擇培養液的 10 cm
組織培養皿中。每個培養皿轉入足量細胞，使轉染那天單層細胞可以有 33% 的匯合度。
重要：從這時起除非特別說明，細胞都在 37°C,5%CO2，含有 0.5ug/ml 四環素-HCl 的培養液中培養。
2.
在合適的限制性內切酶位點使質粒線性化，并把每種質粒的濃度調整為≥0.5 mg/ml。每種粑基因質粒 10~20ug 和 1~2ug
pPGKPuro(每種四環素質粒與帶選擇標記的質粒的摩爾比為 10:1) 與 500ul HEPES 緩沖液在一個干凈的 4 ml
聚丙乙烯管中混合。
3. 進行階段 1 中的步驟 3~13。
重要：階段 1 中要求用含四環素的 DMEM 完全培養液的地方，在本轉染中一定要換成含有 500umol/L L-組氨醇和 0.5ug/ml 四環素-HCl 的選擇培養液。
選擇和克隆轉染細胞
4. 轉染后 48 h, 細胞用幾種稀釋度分到含有 500umol/L L-組氨醉、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四環素的選擇培養液中。細胞密度為每個 10 cm 培養皿大約 1X106 到 3X104、含有大約 1X105 細胞的培養皿需要培養若干個。
可以在幾天內殺死所有未轉染細胞的嘌呤霉素的最低濃度需要在轉染前依靠經驗確定，而且隨著細胞類型不同而有不同。3ug/ml 嘌呤霉素足以篩選轉染的 NIH-3T3 細胞。嘌呤霉素在到的濃度范圍內可以有效地殺死大多數類型細胞。
5. 細胞在選擇培養液中培養 4 天后，接著用 3~4 ml 含有 500umol/L L-組氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四環素的選擇培養液培養。
6. 集落長好以后（選擇培養 12~14 天），在培養皿的底部用圓畫出每個集落的邊界。吸掉培養液，在培養皿的單個克隆上放置無菌的塑料克隆環。每個挑選的集落重復這個步驟。從培養皿中挑選細胞，要求單個集落隔得比較開，而且易于分辨。
7.
用大約 100ul 磷酸緩沖液很快地洗克隆。為了使細胞脫落，加 2 滴 1X 胰酶-EDTA(~100ul) 并放置
30~60s。用巴斯德吸管上下吹打使細胞變松。每個集落轉移到 24 孔組織培養板的一個孔中，每個孔中有1ml 含有 500umol/L
L-組氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和0.5ug/ml 四環素的選擇培養液。
隨后的細胞傳代都用標準方法，如 (1)PBS 快速洗滌，(2)1~3 min 胰酶-EDTA 消化（每個鋪滿細胞的培養皿加 2 ml), 用 10% 小牛血清（3 ml) 稀釋/終止胰酶的活性。
8. 當孔中的細胞長到 80% 匯合度，把它們轉移到 6 cm 組織培養皿中，用含有 500umol/L L-組氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四環素的選擇培養液培養。
NIH-3T3 細胞可以在大約 4~7 天生長到 80% 匯合度；但是不同細胞系甚至不同克隆生長到 80% 匯合度所需的時間是不同的。
9. 細胞在含有 500umol/LL-組氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四環素的選擇培養液中擴大培養（通常細胞進行 1:5 到 1:10 稀釋)。
10. 當單層細胞再次生長到大約 80% 匯合度，每個細胞充隆收集一部分，在液氮中凍存。余下的細胞進行傳代培養，直到數量足夠用于測試靶基因蛋白的誘導表達。測試方法在階段 3 介紹。
以后使用凍存細胞的時候，需要復蘇，然后在含有 500umol/LL-組氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四環素-HCl 的選擇培養液中培養。
階段 3: 分析轉染鈿胞中的蛋白質表達
材料
緩沖液和溶液
貯存液稀釋到適當濃度。
小牛血清（10%)
磷酸緩沖液
1X 蛋白樣品緩沖液
抗體
適于用免疫印跡法測定感興趣的靶蛋白的抗體
凝膠
Tris-甘氨酸 SDS-聚丙烯酰胺凝膠
灌膠所用的丙烯酰胺濃度要適于靶蛋白的觀察，見附錄 8。
培養液
含有 500umol/L L-組氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素的選擇培養液（含或不含 0.5ug/ml 四環素）
不含組氨酸的 DMEM
100 單位/ml 育霉素
100ug/ml 鏈霉素
2 mmol/L 谷氨酰胺
10% 小牛血淸
500umol/L L-組氨醇（由 125 mmol/L 貯液稀釋，在-20°C 貯存）
3ug/ml 嘌呤霉素
Irvine Scientific 公司（Santa Ana,California) 出售不含組氨酸的 DMEM。
適當的時候加四環素，使濃度為 0.5ug/ml(四環素-HCl 溶于 70% 乙醇，濃度 10 mg/ml，貯存于-20°C)。含 0.5ug/ml 四環素-HCl的選擇培養液在 4°C 可以避光保存太約 1 個月。
特殊設備
沸騰的水浴鍋
聚偏二氟乙烯（poiyvinylidene difluoride，PVDF）膜
附加試劑
本方案步驟 13 需要列在附錄 8 中用于免疫印跡法的試劑和設備。
細胞和組織
可誘導表達自身調控的 tTA 并含有攜帶感興趣靶基因的質粒的穩定細胞系
方法
細胞的生長和誘導
1. 誘導前一天晚上，細胞以適當的密度在含有 500umol/L L-組氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四環素-HCl 的 DMEM 培養液中培養，使它們在收獲時可以達到亞匯合態。
2. 第二天，用 PBS 洗細胞 3 次，每次都要輕輕旋轉培養板。
3. 第三次洗滌后，立即加入含有 500umol/L L-組氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素但不含四環素的選擇培養液。細胞在含或不含四環素的培養液中培養 6~48 h。
在穩定轉染的 NIH-3T3 細胞中，通常誘導 6 h 后有 tTA 和靶基因的表達，誘導大約 12 h 后表達達到峰值。
收獲細胞
4. 細胞生長適當的時間后，快速收獲并放到冰浴的管中。
如果用胰酶收獲細胞，先用冷的不含鈣和鎂鹽的磷酸緩沖液洗細胞，然后用冷的含有 10% 小牛血淸的選擇培養液（根據需要，含或不含四環素）終止胰酶的作用。管子立即移到冰桶中。
5. 每個克隆和對照都轉移 0.5X106 細胞到離心管中，然后所有管子在 4°C 以 3000r/min(低或中速）離心 5 min。
6. 加 1 ml 冰冷的磷酸鹽緩沖液洗細胞。如步驟 5 洗細胞，輕輕吸掉上清，不要擾動細胞沉淀。
7. 細胞沉淀放在冰浴上，在離心管架上方的孔中輕快地旋動管于使沉淀變松，然后把它凍存在-70°C。
準備裂解物
8. 細胞沉淀用 30ul 蛋白樣品緩沖液重懸，輕輕地吹打細胞，然后振蕩管子。
這步也可能在凍細胞前進行。
9. 細胞在蛋白樣品緩沖液中煮 10 min。
10. 以最大速度離心 2 min 收集細胞碎片。
11. 在 Tris-甘氨酸 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的每個泳道加 10ul 細胞裂解物。
如果細胞裂解物不立即加到凝膠上，可以在-20°C 貯存，但是在上樣前需要再次煮沸。
12. 用合適的時間跑膠（請見附錄 8)。
13. 蛋白從 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電轉移到 PVDF 膜上，用合適的抗體檢測（請見附錄 8)。
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