| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液和溶液
CsCl ( 固體），CsCl 再分帶溶液，乙醇，溴化乙錠 ( 10 mg/ml )，石蠟油
2. 核酸和寡核苷酸
粗制質粒
3. 離心機和轉頭
Sorvall SS-34 轉頭或相當的轉頭，超速離心機轉頭（最好為垂直式）和離心管
（如果離心時間不是限制因素，可用 Beckman Vti65、角度轉頭 Ti50、Ti65、Ti70 或 Sorvall 的相當產品。使用可快封的 polyallomer 管或相當產品。）
4. 專用設備
皮下注射針頭（21 號），巴斯德吸管或配大口徑針頭的一次性注射器，折光儀（可選），帶有 18 號皮下注射針頭的一次性注射器（5~10 ml, 無菌）
（盡管并非必需，折光儀在估計 CsCl 溶液密度時十分有用。）
二、方法
1. 測定粗制質粒 DNA 的量。最好通過向一個已在天平上調零的潔凈管中加入溶液來測定，每克質粒 DNA 溶液中準確加入 1.01 g 固體 CsCl，閉上管蓋以防蒸發，于 30℃ 溫育促使 CsCl 溶解。輕輕混合溶液直到 CsCl 溶解。
每個梯度的
DNA 用量宜來自不超過 50 ml 過夜培養物的粗制質粒。因為 Beckman VT65.2 轉子的垂直離心管只可容納約 5 ml
CsCl-溴化乙錠溶液，所以來自 50 ml 培養物的粗制質粒 DNA 應重溶于約 3 ml TE ( pH 8.0 ) 中。
2. 向每 5 g DNA 原液中加入 100 μl 10 mg/ml 的溴化乙錠溶液。
溶液的終密度應約為
1.55 g/ml（折射率為 1.3860 )，溴化乙錠的濃度約為 200 μg/ml。以往曾認為，欲使溴化乙錠與閉環 DNA 和線狀 DNA
的結合達飽和，大劑量的溴化乙錠是必需的，所以溴化乙錠的用量要大得多 ( Radloff et al.
1967)。然而，由于高濃度未結合的溴化乙錠可能會使微弱的 DNA 區帶模糊不清以致在紫外線下才能看見。因而近年來成功使用低濃度的溴化乙錠，使得
DNA 區帶在可見光下顯現。不過，當含有低濃度溴化乙錠的梯度載有過量核酸時，又會出現問題：在這種情況下，可能沒有足夠的溴化乙錠與閉環 DNA
和線狀 DNA 達飽和結合。因為在 CsCl-溴化乙錠梯度中大多數溴化乙錠不是與 DNA 而是與存在于粗制質粒 DNA 中的細菌 RNA
結合，所以在超速離心之前用不含 DNA 酶的 RNA 酶處理粗制品，此問題可予解決。如果來自 50 ml DNA 細菌培養物的粗制質粒 DNA 用
3 ml TE ( pH 8.0) 重溶，再用來制備一個 5 ml CsCl-溴化乙錠梯度，則該處理通常不是必需的。
3.
如果使用 Corex 玻璃管，將溶液于室溫用 7700 g ( 8000 r/min，Sorvall SS-34 轉子）離心 5
min；如果使用一次性聚丙烯管，則用 1100 g （3000 r/min，Sorvall SS-34 轉子）離心 10 min。
浮在離心管頂部的暗紅色渣滓是溴化乙錠和細菌蛋白形成的復合物，離心管底部的沉淀是宿主菌被 SDS 和（或）熱裂解而產生的碎片。當宿主菌被 SDS 或煮沸裂解是常會遇到棘手的問題，而用堿裂解產生的碎片較少。
4. 用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣之下、沉淀之上的清亮紅色溶液轉移到適用于超速離心轉子的離心管中，用輕石蠟油或重新分層溶液加滿該離心管。離心時確保轉子中離心管重量的平衡。按照廠家說明密封離心管。
注意給轉子中 DNA 樣品編號。
5. 用適當的轉子于 20℃ 進行密度梯度離心：
Beckman NVT65 轉子 366000 g ( 62000 r/min) 6 h；
Beckman VTi65 轉子 194000 g ( 45000 r/rnin ) 16 h；
Beckman Type 50Ti轉子 180000 g ( 45000 r/min ) 48 h；
Beckman Type 65Ti 轉子 314000 g ( 60000 r/min ) 24 h；
Beckinan Type 70.1 Ti 轉子 331000 g（60000 r/min）24 h。
6. 離心結束后，從離心機上輕輕取下轉子水平放置。小心取出每個離心管，放于覆有錫箔的試管架上。在僅有微光的室內（即關閉頭頂的日光燈)，將離心管放在鐵架臺的鐵箍上。
在普通光照下，于梯帶中心可見兩條
DNA 區帶。上層區帶的內含物通常較少，由線狀的細菌 ( 染色體）DNA 和帶切口的環狀質粒 DNA 組成；下層區帶則由閉環質粒 DNA
組成。管底的深紅色沉淀是溴化乙錠與 RNA 的復合物，位于 CaCl 溶液和石蠟油之間的物質是蛋白質。
如果質粒 DNA
產量較低，可用手提式長波紫外燈檢測離心后的 DNA，可將其與含有分離好的 DNA
的離心管裝在同一鐵架臺的鐵箍上。紫外線照射在離心管上可使溴化乙錠和 DNA
的復合場發出明亮的橘紅色熒光，有助于用針頭或注射器將其吸去。如使用紫外燈，因為質粒 DNA 過度暴露于紫外線下會遭破壞，故應盡快收獲質粒
DNA。此外，應戴上面罩以防眼睛受到紫外線傷害。雖然長波紫外線照射引起的傷害較短波小，但依然能夠損傷眼睛。
7. 收集閉環 DNA 區帶。
(1) 用 21 號皮下注射針頭在離心管頂端扎一個小孔以使液體被吸出時空氣能進入。
(2) 用乙醇小心擦拭離心管外壁以除去任何油脂，然后用一塊 Scotch 膠帶或 Time 膠帶貼于管外壁。
膠帶起密封作用以減少針頭穿刺后的泄漏。
(3) 將一個 5~10 ml 的一次性注射器裝上一個無菌的 18 號皮下注射針頭，將針頭斜面向上地穿過膠帶插入管中，以使針頭的斜面開口正好位于較低的 DNA 區帶 ( 閉環質粒 DNA ) 的下方。
(4) 緩慢吸出質粒 DNA，小心不要攪動上方黏稠的染色體 DNA 區帶。
欲避免染色體 DNA 的污染，不要試圖從梯帶中移去毎一點可見的痕量閉環質粒 DNA。
有些研究者喜歡在移去較低的閉環質粒 DNA 區帶之前先去除較上方的 DNA 區帶。此法不太可取，這是因為位于較上層的黏稠的高分子質量染色體 DNA 能纏繞住閉環質粒 DNA 并將其帶出離心管。
8. 從 DNA 中去除溴化乙錠。
為了減少閉環
DNA 區帶中染色體 DNA 和 RNA 片段的污染，有些固執著將閉環 DNA 重新分層。欲使質粒 DNA
重新分層，應將注射器中的內含物緩慢轉移至一個新的可快速密封的 polyallomer 離心管中，再裝滿 CsCl
重分區帶溶液。密封離心管，再次離心，用如上所述步驟 5~7 回收閉環質粒 DNA。
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