蛋白質和多肽MALDIMS分析的一般方法實驗

甘油 液氮 MgCl2?6 H2O 硫酸銨 HeLa 細胞磷酸緩沖鹽溶液（PBS) 緩沖液 G 緩沖液 H 緩沖液 D TM 緩沖液+0.1 ml L KCl

材料

HeLa 細胞（培養和保存條件見下文。我們也成功地使用過 CellexBiosciences 公司制備并冷凍的 HeLa 細胞)

甘油

液氮

MgCl_2·6 H₂O

硫酸銨

試劑

磷酸緩沖鹽溶液（PBS)

緩沖液 G

緩沖液 H

緩沖液 D

TM 緩沖液+0.1 ml/L KCl

(配方，見"試劑的配制",PP.131~138)

操作程序

HeLa 細胞的培養與保存（12-L 規模)

1)HeLa 細胞對數生長至密度為 5X10⁵ 個細胞/ml, 溫和收集細狍以免裂解。

2) 細胞用 PBS 洗滌一次，并再次收集。

3) 對每升原始培養液所得之細胞加 2 ml 緩沖液 G(即，對由 12L 培養液得到的細胞加 24 ml 緩沖液，再補加甘油至甘油的終濃度為 20%(v/v)。例如，由 12L 培養液可得大約 18 ml 體積的細胞，加入 24 ml 緩沖液 G 后，總體積達 42 ml。但因細胞占了一定體積而使甘油濃度僅為 17.1%，故必須再補加 1.5 ml 甘油，使甘油的終濃度達 20%。

4) 將細胞置液氮中冷凍，儲存于-80℃ HeLa 細胞核的制備（12-L 規模)

除特別說明者外，所有溶液均應保持于 4℃，所有操作亦應在 4℃ 下進行。

1) 室溫下，將 HeLa 細胞（由 12L 細胞密度約為 5X10⁵ 個細胞/ml 的培養液所得之細胞置水中解凍。應盡可能快地使細胞解凍，但不宜使細胞溫度超過 4℃。加入含 lg MgCl₂·6 H₂0/L 的 PBS，至終體積為 200 ml, 再用 BeckmanGSA 轉頭，3000r/min 離心 10 min, 收集細胞。

2) 用 200 ml 含 1g/L MgCl2·6 H20 的 1XPBS 洗滌細胞，用 BeckmanGSA 轉頭，3000r/min 離心 10 min, 收集細胞。

3) 細胞重懸于 60 ml 緩沖液 H。

4) 細胞置冰上孵育 15~30 min。

5) 用 Dounce 氏勻漿器（40 ml) 及 B 杵破碎膨脹的細胞，研磨 20 次。
注：重要的是細胞裂解后的操作要快，使轉錄因子因泄漏至核外而造成的損失減至最小。實際上，在胞質組分離心收集細胞核時的上清液中常見有高濃度的核轉錄因子。因此. 增加洗滌和離心的次數往往會使轉錄因子的得率降低。

6) 用 BeckmanSS-34 轉頭，3500r/min 離心 10 min, 收集細胞核。立即制備核提取物。從 12LHela 細胞培養液一般可獲得約 12 g 細胞核。HeLa 細胞梭提取物的制備（12-L 規模）

除特別說明者外，所有溶液均應保持于 4℃，所有操作亦應在 4℃ 下進行。

1) 取由 12LHeLa 細胞培養液制備的細胞核（如上所述或在冷水（4℃) 中解凍一份凍存的細胞核。

2) 將細胞核懸于 75 ml 緩沖液 D 中。
注：袖提緩沖液中的 0.42mol/L KC1 可用 0.42mol/LNaCl 來代替。

3) 磁力攪拌器攪拌 30 min。

4)100OOOg 高速離心 1 h, 沉淀細胞碎片。
注：對此步離心，建議用吊斗式轉頭如 BeckmanSW28) 而不用定角式轉頭。用后者會對細胞核產生不希望有的剪切作用。

5) 測上清液體積（通常為 70~75 ml)。
注：為制備供體外轉錄實驗用的標準提取物，可將 100000 g 離心所得的上清液對含 0.1mol/LKCl 的 TM 緩沖液進行透析 6 另外, 也可將硫酸銨沉淀物見下文對 TM 緩沖液+0.1mol/LKC1 進行透析。0.42mol/LKC1 提取物中含有髙水平的組蛋白 H1, 它是轉錄作用的潛在阻遏物 (Crceton 等，1991)。硫酸銨沉淀可除去大部分組蛋白 II1, 因此，在樣品對 TM 緩沖液+0.1mol/LKC1 進行透析前，最好先用硫酸銨對 0.42mol/LKC1 提取物作沉淀處理。

6) 每毫升上清液加 0.33 g 硫酸銨粉末，5~10 min 內緩緩加入。
注：在使用前約 5~10 min, 將硫酸銨晶體研碎。硫酸銨粉末有吸濕性，吸潮的疏酸銨難于準確稱量。咖啡豆研磨器是研磨琉醆銨的好器具，比研缽和杵要好使得多。

7) 待所有硫酸銨溶解后，混合物用磁力攪拌器攪拌 30 min。

8) 用 BeckmanSS-34 轉頭，15000r/min 高速離心 15 min, 沉淀蛋白質。

9）將沉淀物溶于約 3.5 ml 的 TM 緩沖液+0.1mol/LKCl 中，并使溶液的終體積約為 5 ml。

10) 所得乳白色混合物用 BeckmanSS-34 轉頭，10000r/min 高速離心10min, 除去不溶物。

11) 上清液一般為乳白色，可直接上 S-300 柱進行凝膠過濾。用 Bradford(考馬斯亮藍法、以牛γ-球蛋白為參照，測定其蛋白濃度一般約為 50 mg/ml。

12) 如需要, 可將提取物置液氮中冷凍，-80°C 下可保存數月（甚至數年)。提取物融化時應盡可能得快些，這一點很重要。而要做到這一點，可將冷凍管置室溫的水中，并去除可能在管周圍形成的冰。提取物融化后，重要的是用 BeckmanSS-34 頭，10000r/min 高速離心 10 min, 除去不溶物另一辦法是將此提取物對 TM 緩沖液+0.1mol/L KCl 透析數小時，至樣品的電導率與緩沖液完全相同，該細胞核提取物即可用于體外轉錄實驗。