蛋白質穩定性的保持

蛋白樣品

蛋白質水解酶 蛋白酶抑制劑

冰箱

一、蛋白質失活的原因

在各種條件下使用不同操作方法從細胞環境中提取蛋白質將會導致其活性的丟失和結構的改變。這些操作包括稀釋，改變溶液條件，暴露于各種降解酶、氧氣、重金屬及各種材，的表面，以及生理條件的變化 (如凍融作用) 等。意識到這其中的任何—個情況都有可能影響蛋白質、了解可能采取的盡量減少這些影響的預防措施，都將有助于確保一個純化草案的成功。如果在任何操作過程中發生目標蛋白質的丟失或失活，那么在確定這種情況發生的原因時將通常會提出一個簡單的解決方案。因此，如果可能的話，檢查蛋白質失活是否伴隨著蛋白質的損失或其結構的變化，或者是否蛋白質仍然存在，但已失活。這些不同可能性之間的區別可能表明了什么類型的操作過程是失活背后的問題，因此也指明了一個適當的解決方案是什么。

二、常規處理方法

顯然，要保持蛋白質的穩定，應避免可以使其變性的處理方法。因此，蛋白質溶液一般不要劇烈攪拌或渦旋，因為這可能會導致蛋白質氧化或表面變性。蛋白質溶液不應暴露于極端的 pH、高溫、有機溶劑或任何其他可能促進變性的條件。同樣，如果在解凍的狀態下長時間儲存一種蛋白質溶液，細菌和真菌的生長將會成為一個問題。在這樣的情況下，無菌溶液和抗菌或抗真菌試劑可能是必要的。最后，最好使用蒸餾水配制將與蛋白質接觸的所有溶液，并且要將蒸餾水儲存在無藻類生長的容器中。

三、濃縮和溶劑條件

從細胞中提取蛋白質不可避免地導致其所在環境的改變。由于蛋白質在體內一般是穩定的，理論上的目標是嘗試去復制盡可能接近于細胞的環境，這就意味著高蛋白質濃度、接近中性的 PH、適中的離子強度、還原狀態的條件等。實際上，這些條件中有些是與蛋白質純化相一致的，有些則不是。如前所述，保持高蛋白質濃度 OlmgZmL) 通常是一個很好的做法。這將有助于保持蛋白質復合物的狀態，可最大限度地減少有害污染物和表面吸附作用的影響，而且為目標蛋白質提供一個普遍穩定的環境。在蛋白質純化的早期保持高蛋白質濃度是相對比較容易的，但隨著蛋白質純化的進行，這將變得更加困難，除非在每個純化步驟之后都進行一次濃縮。因為這些后期的過程通常也存在自身的問題，所以除非特殊的穩定性問題變得很明顯，否則在大多情況下，你可能不得不接受稀溶液。將濃縮蛋白質的純化步驟與稀釋蛋白質的純化步驟進行交替的做法可能是有用的。例如，將結合到層析柱上的蛋白質進行一次性洗脫的操作往往會使蛋白質濃縮，而梯度洗脫則趨向于將其稀釋。使用結合蛋白質的層析柱進行純化趨向于濃縮, 而凝膠過濾則會稀釋。通過明智的安排純化步驟，可能會避免蛋白質溶液被過多的稀釋。

溶液的條件也是極其重要的。雖然不可能描述出適用于每一個蛋白質的一種通用穩定溶液的配制方法，但對于某種蛋白質來說，添加特定的組分通常是有用的。這些條件包括能夠避免不必要的 pH 變化的緩沖體系，體系的 PH 通常在中性附近。應該特別注意緩沖液的陰離子，因為很多情況下 Cr 可能是有害的。EDTA 通常以約 0.Immol/L 的濃度添加，用以螯合可能與蛋白質相互作用或促進氧化的重金屬離子。還原劑（如 2-疏基乙醇或二硫蘇糖醇) 通常用于對抗氧化作用，尤其是半胱氨酸殘基的氧化。可優先使用 0.1?Immol/L 的二硫蘇糖醇，因為它不能和蛋白質形成分子間二硫鍵，而 2-疏基乙醇可以。溶液中應加人足夠的還原劑，如果還原劑過少, 蛋白質會在其耗盡后由于失去保護而被氧化。在某些情況下，要加人鹽以保持一定的離子強度, 但僅限于當它們與下一步的純化或分析步驟相兼容的情況下使用。同樣,5%?20% 的甘油往往有助于保持穩定, 并且這些濃度適用于大多數純化步驟。有時，需要加人低水平的非離子去污劑以防止蛋白質聚集或吸附到所使用器材 (如玻璃器皿）的表面。最后，加人蛋白酶抑制劑是一個很好的做法，特別是在早期的操作步驟之中。

四、穩定性實驗和儲存條件

在一種新蛋白質的純化過程中，最重要的研究之一是穩定性和存儲研究。這意味著在純化過程的每個步驟之后，一定要檢測感興趣蛋白質的穩定性和存儲性。雖然快捷的蛋白質純化過程是人們所期望的，但經常會發生一些意外情況，特別是在一個新的純化過程中，在進行下一個純化步驟之前需要將蛋白質放置一段時間的時候。為此，你需要知道它在不同儲藏條件下的穩定性。最簡單的測試辦法是取少量蛋白質溶液，將它們存儲在不同的條件下 (如儲存于冰上、將其冰凍或在室溫下存放，以及加人或不加人穩定劑），然后在不同的時間段檢測蛋白質的活性。另外，要知道下一個純化步驟是什么。一些存儲條件對穩定很好，但不利于進一步的純化。一個恰當的例子是于一 20°C 將蛋白質存儲在 50% 的甘油 (V/Y) 通常是保持穩定的一個有用條件，但如果你要進行進一步的純化，這是相當可怕的。有時可能有必要應用這樣的程序，即通過透析去除甘油，但這一般是最后采用的解決措施。

當你完成了純化流程并準備長時間存儲所純化的蛋白質時，一個不同的情況出現了。

在這里, 主要關注的是蛋白質的長期穩定性，很多在純化過程中不實用的條件現在變得可用。這些可能包括加人高濃度的甘油、加人穩定性基質, 甚至加入其他蛋白質 (如血清白蛋白）。儲存條件的選擇取決于什么對蛋白質穩定是有效的，以及純化的蛋白質將要作何用。如果你主要的興趣是研究酶的活性，那么血清白蛋白的存在可能無關緊要。相比之下，如果你想要研究蛋白質的結構，那么就不希望有其他蛋白質的存在。如果你不確定，最好是將蛋白質分裝并存儲在不同的條件下。

蛋白質存儲的相關問題還有純化蛋白質溶液的凍融。避免反復凍融的一種方式是將純化的蛋白質分裝成小份，每次按需取出其中的一份或幾份融解; 另外，將蛋白質存儲在非凍結的條件下，如一 2 〇°C 條件下 50% 的甘油中。如果需要反復凍融, 最好是使用快速的凍融程序。在冷凍過程中，溶質濃縮, 蛋白質可能會暴露于異常惡劣的條件中。我們通常將蛋白質速凍于干冰-乙醇浴以避免這個問題。同樣，對解凍蛋白質溶液也應該快速地進行，將其置于緩慢攪拌的溫水浴中，直到樣品溶解到僅剩少量的冰塊時取出。在使用過程中, 溶液解凍后放置于冰上或室溫條件下。最后解凍的溶液應該輕輕地混合，如果溶液在管中可以顛倒，以確保溶質均勻分布。

五、蛋白質水解和蛋白酶抑制劑

蛋白質水解是蛋白質純化的一個主要問題。因為在很多情況下目標蛋白質在部分降解時仍能保留生物活性，所以這是一個特別潛在的問題。而且這一現象這可能會導致在進行蛋白質大小和結構分析時得出錯誤的結論。蛋白質水解可能出現在純化過程的任何階段。因為純化過程總是趨向于消除這些具有水解活性的污染物, 所以一般來說總的水解活性在初始的粗提取物中是最高的。然而，粗提物中也存在著很多可能會保護目標蛋白質的蛋白質。在純化過程中, 一種蛋白酶微量的污染甚至會產生很大的影響，因為大部分可接觸的蛋白質底物可能都是你所需的目標蛋白質。

如果在特定的情況下蛋白質水解是一個問題，你怎么判斷呢？最簡單的測試方法是將提取物或部分純化的蛋白質在溫和的溫度下孵育 (如 30°C)，分時間段取出部分樣品進行生物活性的分析。雖然這種方法并非萬無一失，因為可能會有其他原因導致蛋白質失活，但大多數蛋白質在這樣的條件下不會熱失活。如果活性喪失，建議添加蛋白酶抑制劑，因為在純化過程中即使是將蛋白質保持在 0?4°C 的條件下也會發生一些裂解，除非蛋白酶滅活。

細胞中含有多種不同的蛋白酶類。幸運的是，可用蛋白酶抑制劑作用于各種蛋白酶。

表 10.1 列出了一些常用的蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑用于特定的情況或系統在本書其他章節中有所描述。對于一個新的蛋白質最好的辦法是使用混合的能夠對不同種類蛋白質起作用的蛋白酶抑制劑。這些蛋白酶抑制劑混合物是可以買到的。一旦獲得了保持目標蛋白質穩定性的條件, 可以將蛋白酶抑制劑逐一去除以確定哪一個蛋白酶抑制劑是必需的。將會涉及一些反復實驗, 以便確定哪些抑制劑是純化過程所需要的而哪些則不是。請注意，蛋白酶抑制劑在一定條件下是有毒的和/或不穩定的。在沒有研究清楚它們的性質之前請不要使用。

六、蛋白質活性丟失

在蛋白質純化過程中通常聽到的哀嘆是:「我的蛋白質失去了活性。」當這種情況發生時，需要仔細分析情況，以查明原因。最重要的是，你應該仔細計算酶單位，以評估活力損失的程度。對于許多純化步驟，損失高達 50% 的比例是正常的，當然，蛋白質活性損失的情況對每個蛋白質是不一樣的。一般來說，包含有將蛋白質與基質結合, 并且在結合的過程中可能需要發生構象變化的純化步驟相比于凝膠過濾來說對蛋白質活性的影響更大。

如果在某一個純化步驟蛋白質的活性完全喪失，需要考慮其他的可能性。第一種可能是在某些情況下, 蛋白質可能與層析柱結合得非常緊密，需要使用更加極端的洗脫程序。根據層析的類型 (見本書第 6 部分和第 7 部分)，可能需要增加離子強度、使用一個離液序列比較高的鹽 (如 KBr)，或在洗脫液中加入去污劑或乙二醇。

第二種可能是蛋白質活性的發揮需要多個組分, 這些組分 (如另一個亞基或輔因子）在分級分離過程中被除去了。因此，無論哪一種組分其本身是無活性的，只有在所有組分出現時才可觀察到活性。為了測試這種可能性，可將前一步中的所有組分混合到一起，再檢測其活性。在某些情況下, 有必要將混合物濃縮到原來的體積去觀察其活性。如果混合所有的組分后再次檢測到了活性，則應該以配對的方式檢測這些組分或組分群。經常會發現某個組分有微量的活性而需要第二種組分以達到最佳的活性。此時，所需要的一種組分已經很明確了，而其他組分可以通過測試其刺激活性來確定。

有時在純化步驟之間蛋白質可能會喪失活性，如在透析或濃縮過程中，或甚至在存儲過程中。對于前者，你應該再次檢測除去一種可能需要的組分所產生的結果。也有這樣的可能性, 就是蛋白質依附在透析管或濃縮膜上。對此，用含有一定去污劑的緩沖液沖洗這些管或膜可能會有所幫助。存儲過程中的穩定性問題在上面已經有所討論。

最令人沮喪的情況是以上所有的可能性中沒有一種是蛋白質失活的原因。在這種情況下, 最可能的解釋是蛋白質因變性、水解等確實失活了。如果可以獨立檢測蛋白質 (如 WesternBlot 法），這種情況可以直接顯示。如果不行，可能需要進行反復實驗 (trialanderrorexperiment) 檢測各種條件來尋找失活的原因。有時，最好的辦法是避免特殊的純化步驟。

少量純化 (低于毫克級蛋白質量的純化) 的操作要注意一系列特殊問題。尤其是要特別注意蛋白質因吸附于各種表面而損失的可能性。少量蛋白質與某些表面結合緊密，如玻璃表面和多種塑料表面，常常會高達 Iyg/cm2。在少量蛋白質純化過程中，由于蛋白質的總量本來就很少，所以這些因吸附而損失的蛋白質的量可占到相當大的比例。當然，你應該避免使用聚苯乙烯材料制成的容器 (如微量滴定盤），因為它具有較高的蛋白質結合能力。在這樣的情況下，管道應仔細地沖洗以確保蛋白質的最大回收率。此外，低濃度非離子型去污劑的存在可能有助于防止蛋白質與表面結合。在整個過程中，小心地計算蛋白質的量是相當重要的，這可能會提醒研究者在哪里發生了不必要的蛋白質損失。

1. 加人高濃度的甘油、加人穩定性基質, 甚至加入其他蛋白質 (如血清白蛋白）有利于蛋白質的長期穩定性。

2. 蛋白質儲存應避免反復凍融。

3. 蛋白質抑制劑在一定條件下是有毒的和/或不穩定的，在沒有研究清楚它們的性質之前請不要使用。

4. 蛋白純化過程中容易造成蛋白活性丟失，應注意操作。

來源《蛋白純化指南》