親和層析實驗

蛋白質

Tris TSA 裂解緩沖液 脫氧膽酸鈉 洗滌緩沖液 三乙醇氨緩沖液

層析柱 離心管 離心機

1.  準備一支活化后被淬滅的Sepharose預柱（5 ml 柱床）和一支Ab-Spharose免疫親和層析柱，并將它們串聯起來。

2.  以冰冷TSA溶液重懸50 g 細胞至1~5×10⁸細胞/ml，或往收集的細胞或組織勻漿中加入1~5倍體積的TSA。再加入等體積的冰冷裂解緩沖液，于4℃攪拌1 h。

3.  以4 000 g 離心10 min，除細胞核，輕輕倒出上清，保留之。

4.  對于提純膜抗原，在去細抱核的上清中加入0.2倍體積的5%脫氧膽酸鈉，于水浴或 4℃放置10 min，轉移至quick-seal離心管100 000 g 離心1 h，小心移出上清并保留之。

5.  將預柱連接于免疫親和層析柱。
 

圖一、免疫親和層析柱

6.  依次用下列緩沖液洗柱子：
10倍柱床的洗滌緩沖液
5倍柱床的Tris緩沖液，pH8.0
5倍柱床的Tris緩沖液，pH9.0
5倍柱床的三乙醇氨溶液
5倍柱床的洗滌緩沖液

7.  將上清（保留一些樣品待分析用）上樣于預柱，讓它們以5柱床/h 的流速流過預柱和免疫親和層析柱，按加樣上清體積的1/10~1/100分部收集穿透液。
 

8.  用5倍體積的洗滌緩沖液洗柱子，然后關閉兩根柱子的止水閥。拆離親和柱與預柱的連接，打開親和柱的止水閥，讓柱床上面的液體流至柱床表面。

9.  依次以下列溶液洗柱子，并分部收集流出組分：
5倍體積的洗滌緩沖液
5倍體積的Tris緩沖液，pH8.0
5倍體積的Tris緩沖液，pH9.0

10.  以5倍體積的三乙醇胺溶液洗脫，將每一個柱床體積的洗脫液收集于含0.2體積的1 mol/l Tris·Cl 緩沖液，pH6.7的試管中，以中和冼脫液。

11.  以5倍體積的TSA溶液洗柱子。

12.  分析含抗原的洗脫液組分：每份洗脫液取50 μl SDS-PAGE銀染分析。取0.5~ 1 ml 上柱樣品和有代表性的穿透流出液及洗脫液以Ab-Sepharose免疫共沉淀，并接著進行SDS-PAGE和銀染檢測以確定柱子是否已被飽和。

在每次更換緩沖液時，按下述過程洗免疫親和柱：

1.  關閉止水閥并打開注于上端的帽子。

2.  用一注射器連接于來自緩沖液貯槽的輸液管的出口處，吸去所有液體。

3.  將管子移至盛在另一貯槽中的另一種洗柱緩沖液中，用注射器抽吸，使管子充滿液體，取走注射器，調整流速，并用此緩沖液冼柱子的內壁。

4.  打開止水閥，讓柱子的緩沖液流至往床水平面，放松柱子的上帽讓緩沖液流下到柱床以上幾厘米的水平，收緊帽子，開始洗滌或洗脫。