血清蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗

分離膠緩沖液 單體交聯劑 濃縮膠緩沖液 加速劑：催化劑 電極緩沖液 氨基黑染色液 乙酸 蔗糖

一、試劑

1.分離膠緩沖液(pH8.9)：取Tris36.3克加入1NHC148ml，再加水到100ml。

2.單體交聯劑：取丙烯酰胺30g，N-N-亞甲基雙丙烯酰胺0.8g，加蒸餾水到100ml。

3.濃縮膠緩沖液(pH6.7)：取Tris5.98g加1NHC148ml，加蒸餾水到100ml。

4.加速劑：四甲基乙二胺。

5.催化劑：10%過硫酸銨，取AP1克加水到10ml。臨用前現配。

6.電極緩沖液(pH8.3)：稱取Tris6g，甘氨酸28.9g溶解后加蒸餾水到100ml，用時稀釋到1000ml。

7.0.5%氨基黑染色液：取考馬斯蘭R-250 0.5g，7%冰乙酸10ml，溶解后加水100ml，混勻。

8.7%乙酸：取含量37%的乙酸19ml加水至100ml。

9.20%蔗糖100μl與0.025%溴酚蘭5μl組成樣品稀釋液。

二、凝膠柱的制備

1.取0.5×100cm的玻管，從另一端量取7cm、8cm兩處，分別用玻璃鉛筆劃線，起端管口用小塊玻璃紙包封好，插入橡皮墊，垂直立于試管架上。

2.取小燒杯2個，標號，先按表配制分離膠，待分離膠聚合后再配濃縮膠。

注意抽除溶液中氣泡

3.取1號杯混勻溶液后，用滴管吸取加入上述玻璃管至刻度(離底端約7cm)再以玻璃管小心在膠液上覆以0.5cm厚度的水層，將此玻璃管垂直放在試管架上，約半小時以上，凝膠聚合完成后，用濾紙吸去覆蓋的水層，這是分離膠。按表配制濃縮膠，搖勻，用滴管吸此液加于上述凝膠層，至第二刻度(8cm處)。同樣覆蓋0.5cm厚水層，垂直放于試管架上。聚合后，用濾紙吸去水層，這是濃縮膠。

三、加樣

血清中加1/3體積50%甘油或20%蔗糖溶液，加入少量0.5%溴酚藍作追蹤劑，混勻，吸此樣品30～50μ加在濃縮膠上。沿管壁加入電極緩沖液，直至項端。

四、電泳

1.將制備好的凝膠柱分別插入電泳槽底部的小孔，凝膠管垂直在上槽和下槽中，做好標記。加好上、下槽電極緩沖液(Tris-甘氨酸)，插上電極，上負下正。

2.將電流調至3mA/管，電壓100～200V，當溴酚藍追蹤劑接近管底時(約電泳30分至1小時)，切斷電源，將凝膠管取出(緩沖液倒入回收杯)。

五、剝膠

取下凝膠管，用帶有10cm長針頭注射器，內盛蒸餾水作潤滑劑，將針頭插入膠柱與管壁之間，邊注水邊旋轉玻璃管，直至膠柱與管壁分開，用洗耳球輕輕在一端加壓，使膠柱從玻璃管中慢慢滑出。

六、染色與脫色

從管中取出凝膠柱浸入0.5%～1%氨基黑染液中，一般染色約10～15分鐘，但有的蛋白質需要更長時間。染色后用水沖去多余的染料，放入7%乙酸中脫色，直至余下黑色全部脫去為止。約30分鐘。