相互作用蛋白的捕獲實驗

酵母菌

CM培養基 乙酸鋰 PEG TE DMSO 甘油 氨芐青霉素

離心機 分光光度計 搖床 培養箱

1.  為了轉化文庫，將約20 ml 含pSH18-34和pBait 的酵母菌EGY48培養液接種到Glc/CM-Ura-His 省卻成分液體培養基中，于30℃培養過夜。

2.  將過夜培養液稀釋到300 ml Glc/CM-Ura-His 省卻成分液體培養基中，濃度約為2×10⁶細胞/ml（OD₆₀₀≈0.10），于30℃培蕎至菌密度約為1×10⁷細胞/ml（OD₆₀₀≈0.50）。

3.  室溫下1 000~1 500 g 低速離心5 min，收集酵母菌細胞。菌體用30 ml 無菌水重懸，并移至錐形離心管中。

4.  1 000~1 500 g 離心5 min，棄上清，菌體用1.5 ml TE/0.1 mol/l 乙酸鋰重懸。

5.  取30個微量離心管分別加1 μg 的插入文庫DNA的pJG4-5質粒和50 μg 高純度的剪切均勻的鮭精擔體DNA，其終體積要限制在10 μl 以下，然后分別加入50 μl 重懸的酵母菌液。

6.  分別加入300 μl 40% pEG 4 000/0.1 mol/l 乙酸鋰/TE，顛倒混合直至完全混勻，于30℃溫育30 min。

7.  加入DMSO到終濃度10%（每管約加40 μl ），顛倒混勻，在42℃加熱板上熱休克10 min。

8a.  取其中28管，每管涂布一塊24 cm×24 cm Glc/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基平板，于30℃培養。 

8b.  剩余的2管：毎管取涂布在24 cm×24 cm Glc/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基平板上。剩余的40 μl 用無菌水作1：10的分別等比稀釋，再取稀釋液分別涂布100 mm 的Glc/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基平板，所有平板均置于30℃培養至長出菌落為止（2~3天），一個哺乳動物細胞的文庫的飽和篩選至少需要10⁴個菌落。通過稀釋后所鋪的平板確定轉化效率。

9.  收獲轉化子，將30個24 cm×24 cm 長有轉化子的平板在4℃下放置冷卻數小時，使瓊脂變硬。

10.  戴上手套，使用無菌顯微鏡用的玻片，輕輕地從平板上將酵母菌細胞刮下來。將30個平板上刮下來的細胞收集到1個或2個50 ml 無菌的錐形試管中。

11.  用1體枳的無菌TE或水洗滌細胞，室溫下1 000~1 500 g 離心5 min，棄上清后重復洗滌1次。

12.  用1體積的甘油液重懸沉淀的酵母細胞，混合后分裝成每份1 ml，于-70℃凍存。

13.  復活酵母細胞時，用Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基將1份凍存的轉化酵母細胞作10倍稀釋，于30℃搖床溫育4 h，誘導文庫GAL啟動子， 

14.  接著用Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基系列稀釋酵母細胞（1OD₆₀₀≈2×10⁷細胞）。涂布于100 mm 的Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 營養省卻成分培養基平板，于30℃培養直至長出可見的菌落力止。

15.  計算菌落數，推算出每一小份轉化酵母的cfu 數。

16.  為了選擇陽性克隆，解凍適當量的轉化酵母，按照步驟13稀釋，培養，并以每平板接種10⁶細胞的密度涂布100 mm 的Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基平板。對于每個初次獲得的轉化子，涂布后應保證長出3~10個細胞，用Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省卻成分培養基稀釋酵母菌，于30℃培養2~3天。

17.  待長出菌落后，小心地將菌落轉至新的Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省卻成分培養基主平板上，較早出現的菌落一般較可能是真陽性的，于30℃培養。 

18.  再從Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省卻成分培養基主平板上挑菌落轉至100 mm 的Glc/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基主平板上，于30℃培養至菌落可見為止。

19.  從Glc/CM-Ura-His-Trp 作主平板上挑菌或直接影印平板上菌落至以下平板上。

（1）Glc/Xgal/CM-Ura-His-Trp

（2）Gal/Raff/Xgal/CM-Ura-His-Trp

（3）Glc/CM-Ura-His-Trp-Leu

（4）Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu

20.  針對陽性菌落（在含Xgal平板上顯藍色，并可在Gal/Raff/CM-Leu 如平板上生長但不能在Gcl/CM-Leu 平板上生長的），采用快速小量制備方案從酵母菌中分離質粒DNA，將從15 μl 培養物制得的總DNA濃縮至5~10 μl。
 

21.  用制備好的質粒DNA轉化感受態細菌KC8。涂布于LB/氨芐青霉素平板，37℃過夜培養。

22.  在LB/氨芐青霉素平板上長出的菌落挑至或影印在添加了Ura、His和Leu但不加Trp的細菌極限培養基平板上，以選擇pJG4.5質粒，37℃過夜培養。 

23.  用小量制備細菌質粒的方案純化含文庫cDNA的質粒。

24.  為了分別在不同的轉化實驗中進行特異性驗證，用步驟23純化的質粒轉化已含有下列質粒并生長在Glc/CM-Ura-His 平板的酵母菌。

（1）含pSH18-34和pBait的EGY48

（2）含pSH18-34和pRFHM-1的EGY48

（3）含pSH18-34和非特異性誘餌的EGY48（可選）

25.  將每一種轉化混合物涂布在Glc/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基平板上，于30℃培養直到菌落生長出來。 

26.  對每個待驗證的文庫質粒均涂布一個Glc/CM-Ura-His-Trp 省卻成分培養基的主平板。即從每個轉化平板上挑5~6個單獨的菌落接種到。Glc/CM-Ura-His-Trp 平板上，于30℃培養至菌落上出來為止。

27.  從主平板上挑或影印菌落至在實際篩選中所用的同一系列的驗證平板上：

（1）Glc/Xgal/CM-Ura-His-Trp

（2）Gal/Raff/Xgal/CM-Ura-His-Trp

（3）Glc/CM-Ura-His-Trp-Leu

（4）Gal/CM-Ura-His-Trp-Leu
 

28.  作特異性驗證實驗。分析并測定陽性質粒的DNA序列。