生物藥物分析方法

　　生物藥物包括直接從生物體分離純化所得生化藥物及利用基因重組技術或其它生物技術研制的生物技術藥物及生物制品。由于生物藥物具有毒性低、副作用小、易被吸收的特點，同時具有多方面的生物活性及功能，在疾病的預防、診斷及治療方面有著突出貢獻。隨著人們對生命本質及身體健康的日益關注，生物藥物的研究和開發日趨增加，控制生物藥物的質量，加強藥物分析檢測技術日益受到重視。本文將對用于生物藥物的鑒別、檢查和含量測定的方法進行分析比較，并對近年來生物藥物分析的新方法、新技術的進展及應用前景進行探討。

　　一.生物藥物分析方法

　　生物藥物分析主要包括化學方法、儀器分析方法和生物檢定法。1.化學法

　　化學法包括重量法和滴定法

　　重量法：指待測物經處理后分離出與待測組分相關的單質或化合物，根據其質量，確定該組分的含量。硫酸軟骨素的測定及胰酶中脂肪含量的測定均采用重量法[2]。

　　滴定法：指利用化學反應定量關系，根據消耗標準溶液的體積確定待測物的含量。目前滴定法在我國藥典中仍占有一定的比例，氨基酸類和糖類藥物多用滴定方法進行含量測定[3]。

　　化學方法主要用于常量分析，準確度較高，但操作繁瑣，耗時較長，不利于實現自動化，在藥典及近年來的研究中有所下降。而儀器分析方法的研究、應用與改進則是生物藥物分析的熱點。2

　　.儀器分析方法

　　儀器分析方法用于微量和痕量分析，靈敏度較高。主要包括光學法、電化學法、色譜法、電泳法、酶法、免疫法。

　　2.1

　　光學法

　　在生物藥物分析中常用的光學分析方法有：紫外/可見分光光度法、熒光法、紅外吸收分光光度法、核磁共振、質譜等。紫外/可見分光光度法：主要是利用生物大分子中的某些基團對特定波長具有光吸收作用或某些特殊基團可與某些化學試劑反應生成穩定的顏色，根據吸收光的波長及強度對物質進行定性定量分析。紫外/可見分光光度法由于其設備簡單，價格低廉，操作方便易于普及等特點在藥物分析中應用很廣泛。測定的藥物涉及蛋白質多肽類、酶類、抗生素、維生素及嘌啉類藥物的測定[4，5]。但紫外/可見分光光度法靈敏度不高，一般可達10--4～10-7g/mL。

　　熒光法：利用某些基團在吸收了能量以后能夠發射出一定波長的熒光等性質，對物質進行定性定量分析。近年來鑭系敏化發光的方法在對氨基酸、肽類、蛋白質、核酸、核苷酸、脫氧核苷酸等的分析及藥代動力學的研究中應用較為廣泛[6]。熒光法靈敏、準確、選擇性好、熒光特性參數多，動態線性范圍寬、靈敏度比分光光度法高2～4個數量級，對微量和痕量藥物進行靈敏準確的檢測具有較大的優越性。激光誘導熒光光譜的靈敏度已達10-22g，實現了檢測單個分子的水平，可用于癌癥的早期診斷[7]。熒光法作為一種高靈敏的分析手段，與其它技術相結合，有著更廣闊的發展前景。紅外光譜法在我國藥典中主要用于生物藥物的鑒別和活性成分的分析，目前近紅外光譜法是紅外分析研究的熱點，它具有光譜信息量大，穩定性及重復性好，不需樣品制備，無化學廢料污染等優點，在藥品生產過程中可全面監控整個生產周期的產品質量，在21世紀有很好的應用前景[7,8]。

　　核磁共振波譜是測定生物大分子結構的有力手段，二維及三維核磁共振波譜儀應用于生物工程中蛋白質的三維結構分析[7]。質譜法用于對基因工程藥物多肽、蛋白質、核酸等的分子量測定及結構和序列的證實[9]

　　2.2

　　色譜法

　　色譜法是利用物理或物理化學性質對混合物進行分離分析的方法。

　　薄層色譜法是藥物色譜領域中的重要分支之一，是一種定性和半定量的方法，在自動化程度、分辨率及重現性等方面不如氣相色譜法和高效液相色譜法。薄層色譜法主要用于藥物的鑒別、雜質檢測，如氨基酸類藥物(絲氨酸、亮氨酸和甘氨酸)、酶類(抑肽酶)、蛋白質多肽類(桿菌肽)嘌呤類(硫唑嘌呤、巰嘌呤)的鑒別等。近年來薄層色譜法大力加強標準化、儀器化和自動化改進，如應用自動點樣儀，自動程序多次展開儀，薄層掃描儀等，引入強制流動技術，使薄層色譜法的重現性、準確度和精密度有大幅度提高[7]。

　　氣相色譜法(GC)

　　：對含有揮發性成分的藥物，氣相色譜儀是常用的分析工具。美國藥典中氨基酸等藥物中有機揮發性雜質的檢查采用氣相色譜法。在藥品中殘留的有機溶劑的毒性和致癌作用日益引起人們的重視，用氣相色譜測定藥品中有機溶劑的殘留量也是目前值得重視的研究方向。采用GC-MS-SIM可測定藥物濃度至10-9～10-12g/mL的體液樣品[7]，在體內藥物分析、藥物動力學研究等方面具有較強的優勢。

　　高效液相色譜法(HPLC)：HPLC具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特點，在目前生物藥物的鑒別、檢查和含量分析中占有重要地位[12]。隨著衍生化技術的發展，改善了被測物的檢測特性，提高檢測靈敏度，使HPLC已廣泛用于氨基酸的分析[13]；HPLC也是蛋白質結構和純度分析的重要工具，英國藥典和美國藥典對胰島素的鑒別和效價測定及其中相關蛋白的限量測定均采用HPLC方法，我國藥典中HPLC僅用于鑒別；對于嘌呤類藥物甲氨喋呤與葉酸以及糖類藥物美國也多已應用HPLC進行含量分析。近年來由于檢測器的發展，如蒸發光散射檢測器的應用拓展了對無近紫外吸收的藥物的分析，二極管陣列檢測器、熒光檢測器的應用提供了一種快速有效的高靈敏度的方法。

　　HPLC采用蒸發光散射檢測器直接檢測非衍生化的氨基酸[8]，配合HPLC的分離定量，檢測限達到了ng級，回收率為94%。液相色譜與質譜的聯用在生物大分子、體內藥物代謝和臨床藥物檢測中應用日益增多，多維色譜LC-LC-MS,LC-LC-LC-LC-MS-MS等用于藥物、蛋白質、多肽結構測定，并使整個操作完全自動化，是21世紀色譜分析的發展方向之一。微柱液相色譜由于分析所學的樣品用量及流動相的消耗大大下降，檢測靈敏度大幅度提高，具有廣闊的發展前景。超臨界流體色譜法(SFC):是以超臨界流體作流動相進行分析的一種色譜技術，適用于熱穩定性差、極性大和揮發性小的藥物分析，是GC和HPLC的重要補充技術。SFC在分析激素、抗菌素和依賴性藥物時，只用CO2作流動相就將結構相近的物質分開，并用于尿中咖啡因和激素的測定，在分析一個含多個極性基團，分子量達440的抗菌素時不需衍生化，可直接進樣分析[14]；Bargman等用SFC研究一系列選光性的β-阻抗劑的分離與分析，以分子模型為基礎，提出了手性識別機理。由于超臨界流體色譜法不用或很少用有機溶劑，是一種符合環保要求的分析方法。

　　2.3電泳法

　　電泳法是一種以動電現象為基礎的物理化學分離分析方法，是生物物質分離分析常用方法。醋酸纖維薄膜電泳用于常規血清蛋白、脂蛋白的分離和定量測定；聚丙稀酰胺凝膠電泳用于胰島素有關蛋白質的檢查、基因工程藥物DNA的分離回收；瓊脂糖凝膠電泳具有較大的凝膠孔徑，特別適合于分離和鑒別核酸和核蛋白[2]。

　　高效毛細管電泳(HPCE)是近年來發展迅速的新型分離分析方法，在生物大分子的分析方面具有許多優勢[15,16]。根據分離模式分為：毛細管區帶電泳(CZE)基于各被分離物質的凈電荷與質量比之間的差異，不同離子按各自表面電荷密度的差異，以不同的速度在電解質中移動而致分離。適用于蛋白質、氨基酸、肽、對映體的分析，膠束電動毛細管色譜(MECC)通過將離子表面活性劑加入電解質溶液，形成膠束，使溶質在膠束相和水相之間分配，將分配與電動相結合，不僅能分離離子型物質，也能分離電中性物質；毛細管等電聚焦電泳(CIEF)將傳統的等電聚焦過程移到毛細管內進行，多用于蛋白質，肽類物質的分析。毛細管凝膠電泳(CGE)是以凝膠作支持物進行的區帶電泳可分離測定蛋白質和DNA等大分子化合物。

　　毛細管電色譜(CEC)，多用于水溶性差的物質和水中難進行反應的物質的分析。高效毛細管電泳兼有電泳和色譜技術的雙重優點，對基因工程藥物的分析具有高效、低耗、快速、靈敏等特點，隨著各種不同的預濃縮技術、堆積技術、場放大技術、固相預柱等技術以及新分離模式毛細管電色譜等的應用[7,13]，儀器的不斷改進，高效毛細管電泳將成為生物藥物分析的重要工具。

　　2.4

　　電化學法

　　電化學法是利用物質電化學性質根據電參量的大小確定待測物含量的分析方法。電位定法仍是氨基酸和嘌啉類藥物的常用分析方法[2]。目前微電極、超微電極、化學修飾電極的研究和應用是電化學分析領域中較為活躍的研究方向，如用聚吲哚乙酸修飾電極測定腎上腺素等[7]。電化學檢測器因靈敏度高，選擇性好，應用于毛細管電泳和微柱液相色譜。

　　2.5酶法分析

　　利用酶試劑作為工具測定物質量的方法。酶法分析具有專屬性強、靈敏度高的優點，與其它紫外、熒光、電化學或免疫方法聯用可用于酶的活性分析以及與酶作用的底物或產物的分析以及抗體藥物的效價測定[17,18]。

　　2.6免疫分析

　　免疫分析方法是以特異性抗原-抗體的反應為基礎的分析方法。免疫分析技術和放射性核素示蹤技術、酶促反應或熒光分析等高靈敏度的分析技術相結合，具有高特異性和高靈敏度的特點，特別適合測定復雜體系中的微量組分，以及藥物生產中發酵液或細胞培養液中有效成分的快速測定。如酶聯免疫吸附法(ELISA)用于基因工程藥品中微量致敏性雜質青霉噻唑蛋白的測定[2]，胰島素有關蛋白的檢查[10]等。免疫分析技術與色譜的聯用，利用色譜技術對藥物、激素等分子間微小差別的高識別性，可提高免疫分析的選擇性與靈敏度。

　　3.生物檢定法

　　利用藥物對生物體或離體器官所起的生物活性作用的強弱而進行定量分析的一種方法，可用于藥物的雜質檢查、有害物的毒性測定和藥物的效價測定[2]。我國藥典(1995)對肝素、絨促性素、縮宮素、胰島素等均采用生物檢定法進行效價的測定。生物檢定法一般與藥物的活性、藥效密切相關，結果較為直觀，但使用動物量較多，實驗操作繁瑣，影響因素多，精密度差，現正逐步被理化方法所取代。

　　二.發展趨勢

　　比較中國藥典(95年版)和美國藥典(23版)可以看出，對于生物藥物分析滴定方法在中國藥典中仍占有一定的比例，而美國則對HPLC的應用較為普遍，我國新藥典的科研課題將擴大HPLC的應用：對氨基酸、肽、蛋白質、多糖等進行分子量分布的定性或定量的研究；進一步開發毛細管電泳在生物藥品中的應用：對蛋白質，酶、肽、核苷酸、多糖等進行鑒別、含量測定等項目的研究；加強細胞免疫法的應用：應用細胞免疫法測定效價等。從近年來生物藥物分析的研究報道來看，HPLC已經成為大部分的生物藥物的常規分析方法，而CE因其本身不可比擬的優勢，在生物藥物分析方面的應用日益增多，是未來生物藥物發展的新趨勢。