師兄攻略：流式細胞術第一期

流式細胞儀和流式細胞術指南篇

歷史

從 1968 年最早的商品化流式細胞術 (FC) 和熒光激活細胞分類術 (FACS) 誕生以來, 它們已得到大大改進。但要成為實驗室廣泛接受的技術，除成本因素外，還存在不少障礙。技術上的問題主要是細胞內低豐度分子的檢測，缺少「通用」細胞通透物質，細胞自發熒光的干擾效應，熒光分子間發射光譜的重疊，以及缺少可識別目標分子的試劑。

特別是對于細胞分揀來說，由于液滴的形成收集、分揀細胞重分析或 培養前的稀釋，以及為獲得足夠數量的可用細胞需要的時間延誤的原因，還存在細胞存活問題。最后，特別是在處理低豐度對象時，數據分析也是很棘手的。

有一篇關于流式細胞儀理論的不錯的綜述，介紹了流式細胞儀的操作語言。此外，還有另一篇文章涵蓋了提供流式細胞儀所用特定試劑的 主要抗體供應商。本文將聚焦于以下幾點：

（1） 硬件的選擇和注意事項

（2） 流式細胞儀和細胞分選的實際問題

（3）數據分析和軟件。這幾個話題包含的內容不展開論述

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流式細胞術的常用樣品制備方法篇

流式細胞術的實驗檢測對象是單細胞懸液，因此，在組織化學和免疫組織化學實驗中欲對待測樣品細胞進行分類計數，也需把樣品制備成細胞懸液，并要求被檢細胞大小為 0.2～80 pm，每個樣品中至少有 20 000 個細胞，細胞濃度為 10⁵ ～10⁷ 個／ml。制備成的單細胞懸液經熒光或免疫熒光標記即可上機檢測。

1. 單層培養細胞單細胞懸液的制備

（1）棄去培養細胞(對數生長期)中的舊培養液，加入 1～2ml 0.25％ 胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養 瓶，靜置消化 2～3 分鐘，待細胞逐漸變白，有脫落趨勢時，立即豎立培養瓶，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋白酶；

（2）加入 3～4 ml 無鈣離子和鎂離子的 PBS 液，用吸管反復吹打，使其分散為單個細胞懸液，移入離心管中；

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2. 流式細胞術數據處理與分析

數據的顯示，通常可分為一維單參數直方圖（histogramplot）、二維點圖（dotplot）、二維等高圖（contour）和假三維圖（pseudo3D）等。下面簡述最常用的單參數直方圖和二維點圖。

單參數直方圖單參數直方圖是一維數據用得最多的圖形，可用來進行定性分析和定量分析。橫坐標表示熒光信號或散射光信號強度的相對值，其單位用「道數」（channel）表示，橫坐標可以是線性的，也可以是對數的。縱坐標通常代表細胞出現的頻率或相對細胞數。下面以研究細胞周期為例說明如何分析單參數直方圖所表達的信息。

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3. 如何看流式細胞術結果中的圖

流式細胞結果圖

FCM 數據的存貯的方式是 FCS 2.0（flow cytometry standard），采用列表排隊 (List Mode) 方式。易于加工處理分析，但缺乏直觀性，數據的顯示通常有一維直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖等幾種；由數據還可以做出標準曲線進行定量分析。

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流式細胞術常見問題篇

1. 流式細胞儀上的 FL2-W、 FL2-A、 FL2-H 分別是做什么的？

FL2-W 是只檢測熒光的脈沖寬度， FL2-H 是指脈沖高度。通常在做細胞周期分析時應用，用于去除粘連細胞。

2. 流式同型對照怎樣選擇？

同型對照（IsotypeControl）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用 annormal serum（與一抗相同的正常血清）