三分鐘了解4代基因測序技術

　　基因檢測技術是近年來伴隨“精準醫療”概念的提出而迅速發展起來的一門科學技術，它可以從基因組機制上闡釋遺傳學、發育生物學、進化生物學等學科的經典概念，在全基因組水平延伸了染色體高級構象、細胞異質性、功能模塊等新概念，為精準醫學開辟了應用性新領域。

　　近年來，隨著分子水平的基因檢測技術平臺不斷發展和完善，基因檢測成為臨床診斷和研究的熱點。基因檢測技術應用于遺傳病診斷、罕見病、產前篩查、臨床個體用藥以及腫瘤監診斷療等領城的科研成果也層出不窮。

　　目前，應用較廣的基因檢測技術大致分三類：基因測序、以核酸擴增為基礎的PCR技術，以熒光雜交檢測為基礎的FISH技術。這三類技術溝通構成了基因檢測基礎，大部分基因檢測項目都有賴于這三項基礎技術開展。與PCR和FISH技術相比，基因測序技術可直接讀取DNA分子的30億個堿基序列，具有高通量、數據量大的特點。此外，基因芯片技術應用范圍也較廣。

基因檢測技術對比

　　在本文中，小編匯總了4代基因測序技術并比較其優缺點，以期幫助正在從事基因檢測工作或行業的您，了解這項技術的發展歷程。

基因組學與基因檢測技術的概述

　　基因組學是伴隨“人類基因組計劃”發展起來的一門新興學科，是新世紀科學的莫基學科，已成為生命科學發展的基礎性和引領性學科。20世紀50年代， Watson和 Crick提出DNA雙螺旋結構后，人們對基因的遺傳學功能逐漸有所認識，并開始致力于DNA序列檢測的探索。1975年 Sanger等發明了第一代測序技術并在1980年完成了人類歷史上第一個基因組序列?——噬菌體X174的測序，它標志著人類正是進入基因組學時代。從1985年人類基因組計劃提出，到2001年人類基因組草圖完成，基因組學的研究也從以全基因組測序轉向以基因功能鑒定為日標的后基因組時代。

　　基因檢測技術經過近70年的發，從第一代的雙脫氧鏈測序技術已經發展到第四代固態納米測序技術。測序技術的發展使人們能夠方便準確地獲取大量的基因組信息，并將其應用于疾病的研究，借此人們遜漸認識到基因變異與疾病發生發晨的關系。同時，基因檢測技術也越來越多地被應用于疾病的臨床診斷和治療。

　　第一代測序技術

　　早在1954年， Whitfeld就已經報道使用層析法測定了多聚核糖核苷酸的序列。第一代測序技術的標志是 Sanger于1977年發明的DNA雙脫氧核苷酸末端終止測序法，以及 Maxam和 Gilbert于同年發明的DNA化學降解測序法。其中， Sanger法的核心原理是:由于dNTP的2'和3'都不含羥基，在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應。在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的 ddNTP(分別為: ddATP、dCTP、dGTP和drP)，通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。

Sanger測序工作流程

　　Sanger測序技術操作快速、簡單，因此被廣泛應用。20世紀80年代末，熒光標記技術憑借著更加安全簡便的特性，逐步取代同位素標記技術，由此也誕生了自動化測序技術。由于可以用不同熒光標記4種dNTP，使得最后產物的電泳分離過程可以在一個泳道內實現，用激光對 ddNTP上的熒光標記進行激發，然后檢測不同波長的信號，通過計算機處理信號后可獲得堿基序列，很好地解決了原技術中不同泳道遷移率存在差異的問題。自動化儀測序大大提高了測序效率，如ABI3730和 Amersham MEGABACE測序儀分別可以在一次運行中分析96個或384個樣本。第代測序儀在人類基因組計劃DNA測序的后期階段起到了關鍵的作用，使人類基因組計劃比原計劃提前兩年完成。

　　雙脫氧鏈末端終止法的優點:

　　（1）可用于未知或已知突變的檢測，更容易實行；

　　（2）假條帶的出現減少，結果更加清楚；

　　（3）讀取的長度也較長；

　　（4）因為摻入了同位素標記的三磷酸，末端終止法可以測更小序列的核苷酸鏈；

　　（5）基本適用于所有的突變類型，準確率幾乎100%，在單基因病的基因診斷和產前診斷中仍廣泛。

　　使用雙脫氧末端終止法的缺點：

　　（1）離不開PCR擴增，且只能分析單個的DNA片段，通量小，不能進行基因組層面的分析；

　　（2）自動化程度低，檢測速度慢，對于某些需要快速檢測的疾病不適合；

　　（3）雙脫氧鏈末終止法成本高，不適用于大規模測序。

　　第二代測序技術（NGS）

　　當前最具代表性的第二代測序平臺包括:瑞土羅氏公司( Roche)的454測序儀、美國 Illumina公司的Solexa基因組測序儀、美國ABI公司的 SOLID測序儀等。第二代測序技術的原理是邊合成邊測序，即依照第一代 Sanger測序技術的原理，通過測序儀器捕捉新摻人的末端熒光標記來確定DNA序列組成。鑒于Illumina的NGS技術已經成為市場主流，因此接下來將詳細介紹Illumina的Solexa測序技術的。

Solexa測序工作流程

　　Solexa測序核心技術是DNA簇和可逆終止化學反應。測序前先將模板樣品DNA片段打碎形成100~200bp的片段，然后在這些片段兩端加上特定的測序接頭。而 Solexa高通量測序芯片表面附著一層單鏈引物，兩端連有接頭的單鏈DNA片段通過與芯片表面的引物堿基互補結合，經PCR擴增成為雙鏈。至此DNA的一端就被錨定在測序芯片上，而另一端則隨機和附近的引物互補結合，從而也被固定住，形成“橋式結構。這樣經過反復30輪擴增循環后，每個DNA片段得到約1000倍擴増，形成單克隆DNA簇。然后摻入經過改造的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的DNTP。這些dNTP就是“可逆終止子”，其3'羥基端帶有可化學切割的部分，每個循環只允許摻入1個堿基用激光掃描測序芯片表面，讀取聚合上去的相關核苷酸種類。隨后將這些核苷酸化學切割，恢復3'端黏性。繼續聚合核苷酸。如此循環，直至每條模板序列都被聚合成雙鏈。此過程中帶有熒光標記的dTP能夠釋放出相應的熒光，測序儀據此捕捉熒光信號，之后計算機可以將熒光信號轉化為不同顏色的測序峰圖，便可得知測序樣品的DNA序列

　　較第一代測序技術而言，第二代測序技術的測量通量顯著提高，是目前市場上主流的測序技術。但邊合成邊測序的原理也為其帶來相應不足之處，測序讀長較短和需要模板擴増是兩個主要的弊端所在。第二代測序的讀長一般在700bp左右，為后續的序列拼接、組裝及注釋等生物信息學分析帶來了較大困難；由于PCR反應的靈敏性，導致擴增前后得到的DNA分子片段的數目有較大偏差，因此在分析基因表達方面存在較大的弊端。在此基礎上，無需擴増、讀長更長的第三代測序技術便應運而生。

　　NGS的優勢:

　　（1）高通量，高淮確性，高靈敏度；

　　（2）自動化程度高；

　　（3）成本低；

　　（4）可用于未知物種，未知基因的檢測。

　　第三代測序技術（單分子DNA測序）

　　第三代測序技術基于單分子讀取技術，不需要PCR擴增，具有巨大的應用前景。現有的第三代測序平臺包括美國 Helicos Bioscience公司的 Heliscope遺傳分析系統和 Paciffic Biosciences公司的單分子實時測序系統(SMRT)。兩者均繼承了第二代測序技術的邊合成邊測序的原理，其中SMRT系統是基于零級波導( zero mode waveguide， ZMW)的測序技術。ZMW是種直徑50~100m、深約100mm的孔狀納米光電結構，當光線進人后呈指數衰減，僅靠近基底的部分被照亮。DNA聚合酶被固定在ZMW底部，加入模版、引物和4色熒光標記的dTP后進行DNA合成，只有參加反應的dNTP才能停留在ZMW底部，從而使dNTP的熒光信號被識別。

　　第三代測序技術是計算機學、生物學、化學等多個學科領域研究相結合的結晶，功能非常強大。其顯著特點是單分子測序，即不經PCR，可直接進行邊合成邊測序。這不僅簡化了樣品處理過程，避免了擴增可能引入的錯配，而且不受A、T、G、C這4種堿基含量的影響，因此第三代測序技術能直接對RNA和甲基化DNA序列進行測序。

　　SMRT優點：

　　（1）超長讀取；

　　（2）無需模板擴增；

　　（3）運行時間短，讀取速度可達每秒10個堿基；

　　（4）能夠直接檢測表觀修飾位點。

　　第四代測測序技術（納米孔測序）

　　目前，第二、三代測序技術均是基于光信號的測序技術，都需要昂貴的光學監測系統，并依賴DNA聚合酶讀取堿基序列，大大地増加了測序的成本。因此開發不使用生物化學試劑，直接讀取DNA序列信息的新型測序方法，就成為第四代測序技術的主要思想。其中的代表當屬納米孔測序，如英國 Oxford Nanopore Technologies公司所開發的納米孔測序，是基于電信號的測序技術。它利用鑲嵌于脂質雙分子層中的經過基因工程改造過的-溶血素蛋白作為納米孔道，孔內共價結合有分子接頭。由于A、T、G、C這4種堿基存在電荷差異，當DNA堿基通過納米孔時，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度(4種堿基所影響的電流變化幅度各不相同)，靈敏的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。雖然納米孔測序的優點十分明顯，與前幾代技術相比在成本、速度方面有著很大優勢。但是目前還處在起步階段，在關鍵環節(如納米孔的制造和DNA分子通過納米孔的速度控制方面)還有待改善。

展望

　　縱觀基因組測序技術的發展歷程可以看出，從第一代到第四代測序技術無一例外地均以提高測序通量與讀長、降低測序成本、簡化測序步驟為目標。盡管目前最為先進的納米測序技術具有諸多進步，但仍面臨很多挑戰。我們有理由相信，當前新一代測序技術面臨的難點會逐漸攻破，基因測序指導下的遺傳病診治、精準醫療等能夠更加高效的進行。