Nature三篇文章揭示剪接體組分突變促進癌癥發生

　　RNA剪接是pre-mRNA去除內含子保留外顯子，生成成熟mRNA的過程，對基因的表達具有重要作用。轉錄本水平的RNA異常剪接在多種癌癥類型中被檢測到，目前發現與隸屬于U2 snRNP的剪接因子SF3B1突變有關。據報道，在髓系白血病、淋巴系白血病和實體瘤中，SF3B1在特定殘基位點處反復發生錯義突變，在葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UVM）中高達14-29%，在環狀鐵粒幼紅細胞骨髓增生異常綜合征中高達65-83%。剪接過程主要由U1-U6完成，其中U2主要功能是識別3’剪接位點【1】，突變的SF3B1則導致異常3’剪接位點的使用【2】；U1主要功能是識別5’剪接位點。SF3B1是癌癥中最常被檢測到突變的RNA剪接因子，但SF3B1突變如何促進癌變的機制目前尚不清楚。是否存在其他剪接組分突變驅動腫瘤發生也有待于進一步研究。

　　2019年10月10日，Nature雜志3篇背靠背文章對癌癥中剪接因子突變進行了報道。這三篇文章的標題分別是（1）Spliceosomal disruption of the non-canonical BAF complex in cancer（2）The U1 spliceosomal RNA is recurrently mutated in multiple cancers（3）Highly recurrent non-coding U1-snRNA mutations drive cryptic splicing in Shh medulloblastom，揭示了U2組分SF3B1突變促進癌變的機制，以及髓母細胞瘤、胰腺癌、CLL、HCC、B細胞非霍奇金淋巴瘤等多種癌癥中檢測到非編碼U1-snRNA發生突變。

　　第一篇來自美國斯隆凱特林紀念癌癥中心的Omar Abdel-Wahab和美國華盛頓大學的Robert K. Bradley 合作研究，利用泛癌剪接分析和CRISPR篩選，鑒定出不同的SF3B1突變都對BRD9產生抑制，BRD9是非典型BAF染色體重塑復合物的核心組分。突變的SF3B1識別BRD9基因內一個異常的內含子支點，誘導了來源于內源性逆轉錄病毒元件的毒性外顯子的形成，導致BRD9 mRNA的降解。BRD9的缺失導致CTCF相關基因位點上非典型BAF復合物的結合丟失，促進黑色素癌變。此外，BRD9被證明在UVM中是一種有效的腫瘤抑制因子，在SF3B1突變細胞中糾正BRD9的錯誤剪切能夠抑制腫瘤生長。

　　研究人員綜合分析SF3B1突變細胞系和249例慢性淋巴白血病、骨髓增生異常綜合征和UVM患者樣本的錯誤剪接事件，然后利用CRISPR陽性富集篩選系統進行功能分析。結果顯示，BRD9的缺失促進細胞的轉化。而且，所有攜帶SF3B1突變的癌癥患者其BRD9都有明顯的錯誤剪接；BRD9敲除能夠促進人類UVM、皮膚黑色素瘤、胰腺癌細胞的生長。SF3B1突變導致BRD9內含子序列的外顯子化，即毒性外顯子的形成，破壞了開放閱讀框，引發無義突變介導的RNA降解（nonsense-mediated RNA decay，NMD），降低BRD9 mRNA的半衰期和穩態下全長BRD9蛋白水平，而且沒有產生截短的BRD9蛋白。

SF3B1突變導致BRD9毒性外顯子形成

　　SF3B1突變如何導致BRD9毒性外顯子的形成？據報道，突變的SF3B1促進隱形3’剪接位點的使用，改變野生型SF3B1的分支識別功能。研究發現，SF3B1突變細胞中，BRD9毒性外顯子的形成和不常見的閉合分支位點的使用有關；突變閉合分支位點則BRD9毒性外顯子的形成消失。同時，研究人員鑒定出毒性外顯子形成所必需的外顯子剪接增強子（exonic splicing enhancer）。一旦破壞3’剪接位點和/或外顯子剪接增強子就能夠在SF3B1突變的UVM細胞中增加BRD9蛋白的表達水平，但在SF3B1野生型的細胞中則對BRD9的剪接和表達沒有影響。

　　BRD9和GLTSCR1/GLTSCR1L組成非典型BAF復合物（ncBAF）的一部分，其生化特點和典型BAF、polybromo相關的BAF不同【3】，而且ncBAF和典型BAF在基因組上的靶向位點也不同。雖然ncBAF不像典型BAF、polybromo相關的BAF在癌癥中經常發生突變，但SF3B1突變常常破壞ncBAF。無論是SF3B1突變體表達導致的BRD9蛋白水平減少或者化學藥物導致BRD9降解，都導致BRD9和BRG1、GLTSCR1的相互作用消失，但BRG1和BAF155的相互作用（在三種BAF中都存在）保持完整，說明SF3B1突變體特異性破壞ncBAF。ChIP-seq實驗顯示，BRD9和GLTSCR1共定位，與基因的啟動子、基因主體和增強子結合；CTCF motifs和GLTSCR1有明顯的共定位，和BRG1共定位不明顯。而且，SF3B1突變導致的BRD9缺失引發CTCF相關位點上ncBAF的特異性丟失。

　　最后，研究人員探究了BRD9在腫瘤發生過程中的作用。敲除Brd9或Brg1導致小鼠體內黑色素瘤生長、黑素細胞色素沉積增加，黑素細胞譜系特異性基因的表達增加；異位表達全長的BRD9能夠抑制UVM細胞系和腫瘤移植物的生長。Brd9的缺失可能通過腫瘤抑制子HTRA的表達失調，促進細胞的轉化、腫瘤的維持和轉移進展。此外，利用CRISPR和ASO技術修正SF3B1突變的細胞中BRD9的毒性外顯子形成，能夠有效抑制體外腫瘤細胞的生長和小鼠體內腫瘤的生長，并誘發腫瘤細胞壞死。

修正SF3B1突變細胞中BRD9的剪接顯著降低腫瘤生長速度

　　總的來說，研究證明了攜帶SF3B1突變的多種類型的腫瘤中，非典型BAF都被破壞，驅動了腫瘤的進展；同時揭示了BRD9的腫瘤抑制子的功能及其可能的作用機制，并為治療這類型的惡性腫瘤提供了機制為基礎的治療方案。

　　第二篇文章來自于加拿大多倫多大學的Lincoln Stein課題組。他們在多種癌癥樣本中檢測到在U1 snRNA的高頻熱點突變第3個堿基上發生A>C的體細胞突變，而U1的主要功能是通過堿基配對識別5’剪接位點，這種突變改變了U1和5’剪接位點之間的偏好性，從A-U配對改變到C-G配對，導致了新型的剪接連接，改變了包括癌癥驅動基因在內的很多基因的剪接模式。臨床上，A>C突變和酒精濫用所致肝細胞癌（HCC）和慢性淋巴白血病（CLL）中非突變性侵襲性IGHV亞型相關，同時U1突變對CLL患者的預后不利。

　　第三篇文章來自加拿大兒童醫院的Michael Taylor課題組，報道了在Shh髓母細胞瘤（Sonic hedgehog medulloblastoma，Shh-MB）中U1剪接體snRNA發生高頻熱點突變（第3個堿基，A>G），而這種突變在其他髓母細胞瘤亞型中沒有出現，在36種其他癌癥類型的2442個樣本中檢出率<0.1%。在嬰兒Shh-MB中沒有檢出該突變，但成人期（Shhδ）突變發生率為97%，青少年（Shhα）發生率為25%。U1-snRNA突變導致腫瘤細胞中RNA剪接異常，并導致腫瘤抑制基因如PTCH1失活，激活癌基因如GLI2、CCND2，驅動腫瘤進展。

　　綜上，3篇背靠背的獨立研究揭示了U1剪接體蛋白編碼基因SF3B1突變導致3'剪接位點的識別出現異常，U2剪接體非編碼組分snRNA突變導致5'剪接位點的識別出現異常，進而腫瘤細胞中mRNA出現異常剪接，導致腫瘤抑制因子失活或激活癌基因，促進癌癥發生。這些研究提示我們剪接過程或將是癌癥治療中的潛在靶點。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1038/s41586-019-1646-9

　　https://doi.org/10.1038/s41586-019-1651-z

　　https://doi.org/10.1038/s41586-019-1650-0

　　參考文獻

　　1. Cretu, C.et al. Molecular architecture of SF3 band structural consequences of its cancer-related mutations. Mol. Cell 64, 307–319 (2016).

　　2. Alsafadi, S. et al. Cancer-associated SF3B1 mutations affect alternative splicing by promoting alternative branchpoint usage. Nat. Commun. 7, 10615 (2016).

　　3. Gatchalian, J. et al. A non-canonical BRD9-containing BAF chromatin remodeling complex regulates naive pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat. Commun. 9, 5139 (2018).