雙向電泳操作步驟及相關溶液配置

A． 實驗過程

一 實驗原理：

    2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質分子量不同,而將一向分離后的蛋白進一步分離.這樣就可以得到蛋白質等電點和分子量的信息.

二 實驗步驟：

1. 樣品的溶解

    取純化后的晶體蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右,共處理一個小時.其中每隔10～15分鐘振蕩一次,然后13200rpm離心15min除雜質,取上清分裝,每管70ul,—80oC保存.

2. Bradford法測蛋白含量

    取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量.取 7個10ml的離心管,首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液,再在每管中加入相應體積的雙蒸水（總體積為80ul）,然后,各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的 Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用）,搖勻,2min在595nm下,按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值,再測樣品 OD值.(測量過程要在一個小時內完成).

3. 雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水）

3.1 水化液的制備

    稱取2.0mg 的DTT,用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05％ 的溴酚蘭,3.5ul（0.5％v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻,13200rpm離心15min 除雜質,取上清.在含300ug 蛋白（經驗值）的樣品溶解液中加入水化液,至終體積為340ul,振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質,取上清.

3.2 點樣,上膠

    分兩次吸取樣品,每次170ul, 按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側,再用鑷子撥開Immobiline  DryStrip gels (18cm,pH 3—10)膠條,從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品.注意：膠條使用前,要在室溫中平衡30分鐘；加樣時,正極要多加樣,以防氣泡的產生；壓膠時不能產生氣泡；酸性端對應正極,堿性端對應負極；樣品加好后,加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad),兩個上樣槽必須與底線齊平.

3.3  IPG聚焦系統跑膠程序的設定（跑膠溫度為20℃）

       S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)

       S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)

       S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)

       S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)

       S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共計44110vhs, 19.5小時

    其中S1用于泡脹水化膠條,S2和S3用于去小離子,S4和S5用于聚焦

3.4 平衡

    用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后,在濾紙上吸干（膠面,即接觸樣品那一面不能接觸濾紙,如果為18cm的膠條要將兩頭剪去）,再以超純水沖洗,濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略）,然后用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下,負極端（即堿性端）向上,放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端,酸性端留有溴 酚蘭作為標記）,用平衡液A,平衡液B先后平衡15min.  注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁.

    平衡第二次時,在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片,長度與一向膠條的寬度等同,然后吸取煮好的Marker,轉入SDS—PAGE膠面上,保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時,煮5％的瓊脂糖10ml.

4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE 

4.1 配膠(兩根膠條所用劑量)

      分離膠：（T=8％  80 ml）：溶液于真空機中抽氣后再加APS和TEMED

      30 ％ 丙烯酰胺儲液    21.28ml

      分離膠buffer           20ml      10％APS 220ul     TEMED 44 ul

      雙蒸水                   38.72ml 

      濃縮膠：（T=4.8％   10ml）

      30 ％ 丙烯酰胺儲液     1.6ml

      濃縮膠buffer            2.5ml     10％APS 30ul     TEMED 5ul

      雙蒸水                   5.9ml

4.2 灌膠

      將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時會出現三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保鮮膜封好.

4.3 轉移

      剪兩個小的濾紙片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE膠面的一端.然后,將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5％的瓊脂糖溶液在膠面 上(瓊脂糖凝膠在轉移前十幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態,至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠 面,其中不斷補加5％的瓊脂糖溶液,注意不能產生氣泡.

4.4 跑膠

     濃縮膠  13mA         分離膠  20mA        共約5.5個小時

5. 銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水）

5.1  固定   30min    無水乙醇 200ml+乙酸50ml,用超純水定容至500ml

5.2  敏化   30min    無水乙醇 150ml

                         Na2S2O3?5H2O  1.5688g

                         無水乙酸鈉          34g  

                         先用水溶解Na2S2O3?5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml

5.3  洗滌   5min  ×  3次

5.4  銀染   20min     AgNO3   1.25g   用超純水定容至500ml

5.5  洗滌   1min  ×  2次

5.6  顯影             無水Na2CO3    12.5g   用超純水定容至500ml

                       甲醛(37％)0.1ml, 臨時加

5.7  終止   10min     EDTA—Na2?2H2O  7.3g  用超純水定容至500ml

5.8  洗滌   5min  ×  3次

    注：整個雙向電泳實驗中全部使用超純水,盡量減少離子的影響.

B實驗相關試劑配制

1.Bradford 工作液

95％乙醇             25ml       先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250,溶解完后再加磷

85％磷酸             52ml       酸,最后超純水定容至500ml.過濾后置于棕色瓶

考馬斯亮蘭G250   0.035g     外加油皮紙保存（Bradford不穩定,一周內有效） 

2.裂解液

尿素                 8M

硫脲                 2M

CHAPS             4％

DTT                 60 mM

Tris—base          40 mM（如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5％的Pharmalate）

3. 水化液儲液

尿素                 8M 

硫脲                 2M

CHAPS             4％

Tris—base          40 mM

4. 分離膠buffer (pH8.8)                         250ml

SDS                  0.4％                   1g

Tris—HCl           1.5M                 45.4275g

5. 濃縮膠buffer (pH6.8)                         100ml

SDS                  0.4％                  0.4g

Tris—HCl           0.5M                  6.07g

6.凝膠儲存液（30％的丙烯酰胺）               250ml

Acr                  29.2％                  73g

Bis                   0.8％                   2g

7. 電極緩沖液（跑一次要配制2500ml）

甘氨酸             43.2g                   36g

Tris                  9g         或           7.5g

SDS                 3g                      2.5g                

超純水定容至3000ml                    超純水定容至2500ml

8.0.5M Tris —HCl pH 6.8儲液

6.1g Tris先用30ml超純水溶解,再用46ml,3M HCl調pH6.8,再加水定容至100ml

9.平衡液儲液

脲（即尿素）         36g

甘油                    30％                  30ml

SDS                    1％                   1g

0.5M Tris—HCl pH6.8  10ml              超純水定容至100ml

10. 平衡液A（一根膠條）

DTT                   20mg

平衡液儲液           10ml

11．平衡液B（一根膠條）

碘乙酰氨             300mg

平衡液儲液           10ml

0.05％溴酚蘭          15ul              (平衡液A、B均需臨時配制)

12．0.5％瓊脂糖10ml

瓊脂糖                0.05g

電極緩沖液           10ml

溴酚蘭                25ul

補：4、5、6的溶液需過濾后儲存于4℃備用.