單個神經細胞標記實驗

貓的小腦

利多卡因 Karnovsky 型固定液 甲酚紫

微電極 電鏡或光鏡

微電極

直徑 0.4—0.9/xm, 圓錐形，電極內液為含 4%~10%HRP 的 0.5mol/LKCl-Tris 緩沖液，pH 為 7.6，電阻抗為 35~60Mfl。

一、注射

每秒 3~5 次去極化直流電脈沖，每次通電時間 100?200ms, 電流強度為 3~5nA, 持續時間為 3~5 min。

二、固定

根據神經細胞的大小及需要充填的范圍，可于注射 HRP 后 15 min 到 30 h 固定動物。先用含 2% 利多卡因的 0.9% 生理鹽水經血管進行灌注，利多卡因的量為 40 mg/kg，再用 Karnovsky 型固定液灌注（含 1% 多聚甲醛、2% 戊二酸和 2.5% 葡萄糖的磷酸鈉緩沖液，pH 為 7.3, 終濃度為 0.1md/L)。

三、切片及處理

連續冷凍切片（光鏡）或振動切片（電鏡或光鏡)，片厚 50~60pm, 切片收集于磷酸鹽緩沖液；DAB 反應；光鏡的切片用明膠貼于鉻磯涂層的載玻片上（用甲酚紫復染)。電鏡或光鏡切片先用丙酮脫水，再用環氧樹脂包埋。

結果

Purkinje 細胞的胞體和樹突在 Golgi 法染色和 HRP 細胞內標記后具有非常相似的形態，只是在用 HRP 標記時，最細小的分支（樹突棘）也能很好地顯示 [至少在 a 運動神經元是這樣，Brown 和 Fyffe(1981) 的研究工作表明用 HRP 進行細胞內標記比以往任何方法都能更完整地顯示神經細胞的樹突結構]。然而，用 HRP 進行細胞內標記的時候，在標記軸突的同時，還能標記軸突側支及終末分支（圖 1-6)，而 Golgi 法僅能染出軸突無髓鞘包被的初始部分（圖 1-5B)。除了功能方面的諸多應用以外，可將 HRP 法用于研究皮質-核團之間投射的精細結構和組合（organisation)。