細胞系的多位點DNA指紋檢測

D-PBS HinfI酶及其緩沖液 瓊脂糖凝膠 5×TBE儲存液 EDTA二鈉鹽 6×上樣緩沖液 2×SSC 20×SSC

酸性洗液 堿性洗液 中和洗液

1. 約10⁷ 個細胞（用細胞刮或胰蛋白酶消化收集）用 D-PBSA （不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸鹽緩沖液，PH 7.2）洗滌 2 次至細胞團塊。

2. 提取高分子量基因組 DNA，取一小部分用小型凝膠電泳來檢測 DNA 的完整性，如步驟 6 中所述，常規用于細胞系，并可避免使用酚的 DNA 抽提術，見 Stacey 等 [1992] 的描述。

3. 取 1：50 稀釋液，用紫外線分光光度計測定 DNA 含量 [ Sambrook et al.，1989 ] 。

4. 將 5 μg DNA 和 40 U HinfI 酶、3 μl 10× 酶緩沖液（例如，Life Technologies）及無菌蒸餾水混合配成總體積為 30 μl 的混合液。

5. 混合液 38°C 孵育過夜，重新混勻，1 h 后離心消化產物。

6. 取 1 μl 消化產物加人電泳緩沖液（1× TBE（pH 8.2，54 g Tribase (Sigma)，27.5 g 硼酸（Sigma）和 20 ml 0.5 mol/L 的 EDTA 二鈉鹽（sigma）） 和 2 μl 的 6× 上樣緩沖液（沖洗 0.25 % （W / V） 溴酚藍，0.25 %（W / V ） 二甲苯蘭和溶于蒸餾水中的 40 % （W / V ）蔗糖），經小型瓊脂糖凝膠電泳（0.7 % 瓊脂糖（1A 型，Sigma）溶于 1× TBE，1 mg/L 溴乙啶）檢測是否消化完全。HinfI 酶消化應出現低分子量 DNA 片段拖影（5 < kb )，而無殘存的基因組 DNA 條帶（20~30 kb )。

7. 在剩下的消化產物中，加人 6 μl 的 6× 上樣緩沖液混勻，將其點樣于分析用的瓊脂糖凝膠（0.7 %，1× TBE，含 1 mg/L EB，至少 20 cm 長），平行的有 HindⅢ 的消化標記物及來自標準細胞系（如 HeLa） 0.5 μg DNA 消化產物。以大約 3 V/cm 進行電泳，直至 2.3 kb 的 HindⅢ 片段跑完凝膠全長（即 17~20 h 后），加白色標尺作對比，通過紫外光透射儀對凝膠拍照，記錄區帶遷移距離。

8. 先用酸性洗液（0.1 mol/L HCl 500 ml）處理分離后的 DNA 片段（15 min），再堿性洗液（0.2 mol/L NaOH，0.6 mol/L NaCl 500 ml）處理 （30 min），最后用中和洗液（pH 7.6，1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris 500 ml）處理（30 min）。參考Sambrook 等 [1989] 的方法，最簡單的方法是用 20× SSC 轉移緩沖液（175.3 g NaCl （Analar，Merck）和 88.2 g 檸檬酸鈉（Analar，Merck）溶于蒸餾水中，定容至 1.0 L，PH 7.2），利用毛吸作用，使瓊脂糖凝膠轉移到尼龍膜上（HybondN，Amersham），然后以 2× SSC （由 20× SSC 儲存液稀釋10倍）沖洗該膜，干燥，用莎綸膜（Dow） 或類似物包裹。

9. 使用紫外光透射儀（例如，TM 20，UVP Inc），將 DNA 片段暴露于紫外線 （302 nm） 下 5 min，將其固定在膜上。

10. 在進行雜交前，已固定的膜應置于干燥的塑料袋中避光保存。

1. 溴化乙啶是一種潛在致癌物。

2. 涉及放射性物質的操作，應該按照國家和當地條例進行操作，開展這樣的工作之前要向當地生物安全部門咨詢。