| 實驗方法原理 |
活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。 |
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| 實驗材料 | 細胞樣品 |
| 試劑、試劑盒 | PBS DMSO 胰蛋白酶 甘氨酸緩沖液 二甲亞楓 |
| 儀器、耗材 | 加樣器 96孔培養板 酶標儀 培養板 |
| 實驗步驟 |
一、實驗前應明確的問題
1. 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
2. 藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
3. 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。
4. 培養時間。200 ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來說，很難維持68 h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48 h換液的。
5. MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
6. 理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。
7. 實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。
8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。
1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 ul，鋪板使待測細胞調密度至1 000-10 000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
2. 5% CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100 ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況。
3. 5% CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4. 每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。
5. 終止培養，小心吸去孔內培養液。
6. 每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7. 同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）
三、懸浮細胞
1. 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1x106/ml，按次序將
2. 置37℃，5% CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）
4. 離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。
5. 同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。
四、MTT的配制
MTT一般最好現用現配，過濾后4oC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.
配制MTT時用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
1. PBS配方
（1）NaCl ：8 g。
（2）KCl 0.2：g。
（3）Na2HPO4 ：1.44 g。
（4）KH2PO4：0.24 g。
（5）調pH7.4。
（6）定容1 L。
五、細胞的接種（鋪板）
細胞過了30代以后就不要用了，因為狀態不好了；培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。
接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種， 因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線性關系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養會不夠，最后導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。
細胞密度要根據不同細胞的特點來定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105，貼壁細胞可為103-104。
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| 注意事項 |
1. 選擇適當得細胞接種濃度。
2. 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。
3. 設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。
MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！
舉個例子：
各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21、0.06。代入計算公式：
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
參考公式：
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大劑量
I:lg(最大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應率之和
Pm: 最大陽性反應率
Pn: 最小陽性反應率
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值
公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率
例：
用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力，應該加多少1640培養基，多少MTT和DMSO合適根據書上說的加200 ul 1640，20 u lMTT，150 ul DMSO加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定，一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20 ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150 ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。
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| 其他 |
一、經驗總結
2. MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20%的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。
3. 我做的是腫瘤細胞的MTT實驗，這種細胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的，結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關系.后來調整濃度，用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實驗，結果發現做的結果比較好點的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組，由于細胞少，藥物作用的梯度還是有，只是沒有很好的線性關系.還有根據細胞生長速度以及藥物的特性（有時間依賴性和濃度依賴性的藥物）來確定培養時間是48小時還是72小時.
4. 注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。 1. 吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3-4倍，可能比較容易混勻。10 ml的離心管里面最好裝3-4 ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。
2. 吸管的吸液量最好在1 ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1 ml多的吸管，總液量在5 ml左右為益。
3. 吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。
4. 吹打次數100左右，就可以吹打均勻了（有人認為加細胞前吹打30-50次基本就差不多均勻了。加細胞的時候每接種2孔反復吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）
5. 向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快，否則你會發現細胞在加入的瞬間會由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會產生接觸抑制，影響細胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復3下移動，目的是使得細胞能分散的均勻些。（鋪板技術是MTT實驗的關鍵，也是基礎，一定要練好。曾經有同學用漩渦振蕩器混勻細胞，最后細胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細胞。
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