葉綠體的分離與熒光觀察實驗方法與步驟

葉綠體  足植物細胞所特有的能量轉換細胞器，光合作川就是在葉綠體中進行的。由于具有這一重要功能，所以它一直是細胞生物學、遺傳學和分子生物學的重要研究對象。葉綠體是植物細胞中較大的一種細胞器，利用低速離心即可分離集中進行各種研究。

實驗目的

一、通過植物細胞葉綠體  的分離。了解細胞器分離的一般原理和方法。

二.觀察葉綠體  的自發熒光和次生熒光.井熟悉熒光顯微鏡的使用方法。

實驗原理

將組織勻漿后懸浮在等滲介質中進行差迷離心，是分離細胞器  的常用方法，一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質的粘度有關。在一給定的離心場中，同一時間內，密度和大小不同的顆粒其沉降速度不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮中的顆 粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部.分批收集即可獲得各種亞細胞組分。

葉綠體的分離應在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4moJ/L蔗糖溶液)中進行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。將勻漿液在1000r/min的條件下離心2min，以去除其中的組織殘渣和一些未被破碎的完整細胞。然后，在3000r/min的條件下離心5mia，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細胞核  )。分離過程最好在0—5℃的條件下進行：如果在室溫下，要迅速分離和觀察。

熒光顯微術是利用熒光顯微鏡對可發熒光的物質進行觀察的一種技術。某些物質在—定短波長的光(如紫外光)的照射下吸收光能進入激發態，從激發態回到基態時，就能在極短的時間內放射出比照射光波長更長的光(如可見光)，這種光就稱為榮光.若停止供能熒光現象立即停止。有些生物體內的物質受激發光照射后直接發出熒光，稱為自發熒光(或直接熒光)，如葉綠索的火紅色熒光和水質素的黃色熒光等。有的生物材料本身不發熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發出熒光，這種熒光稱為次生熒光(或間接熒光)，如葉綠體吸附吖啶橙后可發桔紅色熒光。

利用熒光顯微鏡對可發熒光物質進行檢測時，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時應抓緊時間，有必要時立即拍照。另外，在制作熒光顯微標本時最好使用無熒光載玻片，益玻片和無熒光油。

實驗用品

一、器材

1、主要設備：普通離心機、組織搗碎機，粗天平、熒光顯微鏡。

2、小型器材，500ml燒杯2個，250ml量筒1個，滴管10支，10ml刻度離心管20支，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。

二、材料 新鮮菠菜

三、試劑 0.35mol/L氯化鈉溶O.01%吖啶橙(acridine orange)。

實驗方法

1、選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈，稱30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中，裝入組織搗碎機。

2、利用組織搗碎機低速(5000r/min)勻漿3—5min。

3、將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。

4、取濾液4ml在1000r/min下離心2min。棄去沉淀。

5、將上沾液在3000r/min下離心5rmin.棄去上清液，沉淀即為葉綠體(混有部分細胞陔)。

6、將沉淀用0.35mol/LNaCI溶液懸浮。

7、取葉綠體懸液一消滴于載片上，加蓋片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察。

①在普通光鏡下觀察。 ②在熒光顯微鏡下觀察。 ③取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，加無熒光蓋片后即可以熒光顯微鏡下觀察。

菠菜葉手切片觀察 用剖須刀將新鮮的嫩菠菜切削一斜面置于載片上，滴加1--2滴0.35mol/LNaCI溶液，加蓋片后輕壓，置顯微鏡下觀察。

①在普通光鏡下觀察。 ②在熒光顯微鏡下觀察。 ③用同樣方法制片，但滴加I--2滴0.01%吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加蓋廾后即町以熒光顯微鏡下觀察。

實驗結果

一、葉綠體的分離和觀察

1、普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。

2、以Olympus熒光顯微鏡為例，在選用B(blue)激發濾片，B雙色鏡和O530(orange)阻斷濾片的條件下，葉綠體發出火紅色熒光。

3、加入吖啶橙染色后，葉綠體可發出桔紅色熒光，而其中混有的細胞核則發綠色熒色。

二、菠菜葉手切片觀察

1、在普通光鏡下可以看到三種細胞

(1)表面細胞：為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細胞。 (2)保衛細胞：為構成氣孔的成對存在的腎形細胞。 (3)葉肉細胞：為排成柵狀的長方形和橢幽形細胞。

葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。

2、在熒光顯微鏡下，葉綠體發出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱。氣孔發綠色熒光，兩保衛細胞內的火紅色葉綠體則環繞氣孔排列成一圈。表皮細胞內葉綠體數量要比葉肉細胞少。

3、用吖啶橙染色后，葉綠體則發出枯紅色熒光，細胞核町發出綠色熒光，氣孔仍為綠色。