三種植物基因克隆的策略與方法

基因的克隆就是利用體外重組技術，將特定的基因和其它DNA順序插入到載體分子中。基因克隆的主要目標是識別、分離特異基因并獲得基因的完整的全序列，確定染色體定位，闡明基因的生化功能，明確其對特定性狀的遺傳控制關系。通過幾十年的努力由于植物  發育，生理生化，分子遺傳等學科的迅速發展，使人們掌握了大量有關植物優良性狀基因的生物學和遺傳學知識，再運用先進的酶學和生物學技術已經克隆出了與植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆，育性、高蛋白質及與植物發育有關的許多基因。我們實驗室對天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等，1995;舒群芳等，1997)，為了克隆植物基因也探討了其它克隆方法，本文論述基因克隆的策略。

1　功能克隆  (functional Cloning)

功能克隆就是根據性狀的基本生化特性這一功能信息，在鑒定和已知基因的功能后克隆(Collis，1995)。其具體作法是:在純化相應的編碼蛋白后構建cDNA文庫或基因組文庫，DNA文庫中基因的篩選根據情況主要可用二種辦法進行，(1)將純化的蛋白質進行氨基酸測序，據此合成寡核苷酸探針從cDNA庫或基因組文庫中篩選編碼基因，(2)將相應的編碼蛋白制成相應抗體探針，從cDNA入載體  表達庫中篩選相應克隆。功能克隆是一種經典的基因克隆策略，很多基因的分離利用這種策略。

Hain等從葡萄中克隆了兩個編碼白藜蘆醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2)，葡萄中抗菌化合物白藜蘆醇的存在，可以提高對灰質葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性，在煙草和其它一些植物中無二苯乙烯合成酶，因此克隆該基因經過轉基因后，對有些植物產生對灰質葡萄孢的抗性很有意義(Hain等，1985)。Kondo等1989年對編碼水稻巰基蛋白酶抑制劑的基因組DNA做了克隆和序列分析(Kondo等，1989)。周兆斕等構建了水稻cDNA文庫，分離了編碼水稻巰基蛋白酶抑制劑的cDNA(周兆斕等，1996)。植物蛋白酶抑制劑是一類天然的抗蟲物質，它可抑制攝食害蟲對蛋白質的消化，使害蟲因缺乏所需氨基酸而導致非正常發育或死亡。胡天華等人從煙草中分離出流行于我國的黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV)，并克隆了編碼該病毒外殼蛋白的cDNA基因(胡天華等，1989)。王春香等從感病的煙草葉片中分離純化了馬鈴薯x病毒(potato virus X， pvx)，克隆了完整的馬鈴薯x病毒外殼蛋白基因，并將外殼蛋白基因轉入馬鈴薯中，以期獲得抗pvx病毒的栽培種馬鈴薯(王春香等，1991)。病毒外殼蛋白(Coat protein cp)基因的成功克隆，可使轉基因植物中產生病毒外殼蛋白基因介導的抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介導的抗性。Van kan 報道從真菌中成功的克隆出無毒基因Avr9，可直接利用此基因介導廣譜高效的基因工程植物(Van Kan等，1991)。我們1995年構建了天麻cDNA文庫，制備抗體探針成功地分離了編碼天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆，為抗真菌基因在農業、醫藥等方面的應用打下了基礎(舒群芳等，1995;舒群芳等，1997)。功能克隆的特點是用基因表達的產物蛋白質來克隆基因、雖然某一性狀的編碼基因是未知的。如果對其生理生化及代謝途徑研究的比較清楚，就可以分離和純化控制該性狀的蛋白質。因此功能克隆的關鍵是分離出一個純度很高的蛋白質。只要有一個純的蛋白質，得到十分特異的探針，這一策略是行之有效的。采用功能克隆方法雖然已經克隆了很多基因，但由于絕大多數基因的產物目前還不知道。所以大多數基因難以用這一經典的方法來克隆。隨著分子生物學技術的發展，一條新的基因克隆策略逐漸形成，這就是定位克隆。

2　定位克隆(Positional cloning)

根據遺傳連鎖分析，染色體步移將基因定位到染色體的一個具體位置上后不斷縮小篩選區域進而克隆該基因，研究該基因的功能或抗性的生化機制，這樣一種策略叫定位克隆(Monaco，1994)。連鎖分析即通過基因與DNA標記之間的重組系數來估計這兩者之間的距離，若某種性狀的基因與DNA標記在子代不分離，即有連鎖在一起的趨勢。根據這一原理可將與已知的某一DNA標記連鎖的基因在染色體上定位。由于連鎖分析需要依賴特定的基因作為連鎖標記，即標記基因與待研基因之間存在連鎖關系，而滿足與待研基因相連鎖的基因實在太少，所以連鎖分析對克隆大多數基因存在著一定的困難。RFLP的出現使多態性基因標記存在于整個基因組內，解決了連鎖分析中難以克服的困難。

1980年Wyman等科學家首次建立了限制酶切片段長度多態性RFLP (restriction fragment length polymorphism)，使對任何一種表型相關的基因的定位成為可能。限制酶切片段長度多態性是用限制性內切酶切割后產生的DNA片段長度的多態性呈孟德爾式遺傳，是存在于全基因組的獨特的多態標記，RFLP使基因定位變得易行(Wyman等，1980)。目前定位克隆一般是用RFLP等分子標記制作遺傳圖譜，尋找與待測基因連鎖的RFLP標記，獲得基因在染色體上的定位然后克隆基因。所以RFLP和后來發展起來的RAPD技術的建立，可將待測基因相對準確地定位，利用已知的基因可分離與之連鎖的未知基因。其基本程序是構建一個基因組文庫、用已知的A基因為探針，從基因組文庫中篩選出與其有同源序列的a克隆，再用a克隆為探針從基因組文庫中篩選出與a克隆有同源序列的b克隆，然后以此類推最后篩選出未知基因并把它分離出來。目前已在番茄、煙草、大麥、水稻、大豆、玉米等植物中發現了與抗病基因緊密連鎖的RFLP標記并構建了遺傳圖譜(Figdore等，1988;Heun等，1991;Smith，1991;Diers等，1992)。用這種方法已分別克隆到擬南芥菜、番茄、水稻等植物中的有關抗病基因(Martin等，1993;Bent等，1994;Mindrinos等，1994;Wenyuan等，1995) 。Martin等1993年最早用定位克隆技術克隆出番茄pto基因，pto基因負責對帶有無毒基因Avrpto的細菌，丁香假單胞菌(pseudomonas syringae pv)菌株的抗性，Pto基因導入感病番茄后轉基因植株增強了對病原菌的抗性(Martin等，1993)。Wenyuan等1995年用這一技術克隆了水稻Xa21基因，Xa21基因對真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具有抗性(Wenyuan等，1995)。

3　轉座子標記法(transposon tagging)

轉座子是可從一個基因位置轉移到另一位置的DNA片段。在轉座過程中原來位置的DNA片段(轉座子)并未消失，發生轉移的只是轉座子的拷貝、基因發生轉座可引起插入突變使插入位置的基因失活并誘導產生突變型或在插入位置上出現新的編碼基因。通過轉座子上的標記基因(如抗藥性等)就可檢測出突變基因的位置和克隆出突變基因來。轉座子標記法是把轉座子作為基因定位的標記和通過轉座子在染色體上的插入和嵌合來克隆基因(Fedoroff等，1984;Jones等，1994)。

利用轉座子克隆植物基因的操作步驟主要應是以下幾方面:(1) 把已分離得到的轉座子與選擇標記構建成含轉座子的質粒載體。(2) 把轉座子導入目標植物。(3) 利用Southern雜交等技術檢測轉座子是否從載體質粒中轉座到目標植物基因組中，這是轉座子定位和分離目標基因所不可缺少的。(4) 轉座子插入突變的鑒定及其分離(Ellis等，1992)。通常用于克隆植物基因的轉座子有玉米的Ac. Mu， Smp和Ds等。Ac含有編碼轉座酶的基因，能夠自主的轉座，Ds不含轉座酶所以不能自主的轉座，但Ds-Ac系統因Ac為Ds提供了轉座酶就可以自主的轉座了。用轉座子標記法進行植物基因的分離，首要的是把Ac等轉座子轉化到要進行基因克隆的植物中，目前多數是利用土壤農桿菌介導的轉化系統把轉座子導入目標植物中(Keller等，1993;Bancroft等，1993)。目前已在玉米、煙草、番茄、亞麻等植物中克隆出抗性基因(Johal和Briggs，1992;Whitham等，1994;Jones等，1994;Gregory等，1995)。Johal和Brigge分離出抗灰色長蠕孢(Helminth osporium carbonum)1號小種玉米的HMI特異真菌抗性基因。該基因存在于玉米的抗性品種中，能夠分解長蠕孢1號小種產生的對玉米具特異致病性的HC毒素，該基因編碼HC毒素脫毒酶可使植物具有抗病性(Johal和Briggs，1992)。和轉座子標記法的原理相似的還有T-DNA標記法，兩者都是由于一段基因的插入導致染色體結構發生變化產生突變體，而T-DNA標記法產生的突變是由于T-DNA插入導致的。Kenneth等利用T-DNA插入標記培育出擬南芥矮化突變體(Kenneth等，1989)。