125IUdR釋放試驗測定NK細胞活性

YAC-1細胞                                                          

125I-UdR（125I-2′脫氧尿嘧啶核苷）                                                                  胰蛋白酶                                                                  DNA酶                                                                  5-氟脫氧尿嘧啶核苷                                                                  RPMI-1640培養液                                                          

塑料試管                                                                  γ-計數儀                                                                  離心機                                                          

2. 胰蛋白酶：用無Ca2+、Mg2+的Hanks液配制成3mg/ml，小量分裝，-20℃凍存。

3. DNA酶：用Hanks液配成50μg/ml，小量分裝，-20℃凍存。

4. 5-氟脫氧尿嘧啶核苷（5-FudR）用生理鹽水配制成1×10-3 mol/L，4℃冰箱保存。

5. 其余材料同上。

二、操作方法

1. 靶細胞的制備：取培養24～48h的靶細胞1ml（5×105 /ml），分別加入5-FudR 4～6μl和125I-UdR 6μCi，混勻，置37℃培養2h，取出后用含5%NCS的1640營養液洗滌3次，每次離心1500r/min，2min，最后用完全RPMI-1640培養液懸浮，計數活細胞。用γ-計數儀檢測標記率，一般可達1～2cpm/細胞即可；

2. 效應細胞的制備：用常規方法分離PBMC或小鼠脾細胞，最后用完全RPMI-1640培養液懸浮并計數；

3. 效-靶細胞作用：調整效應細胞和標記的靶細胞濃度，分別加入塑料試管中，效/靶細胞比例為100:1。同時設只加標記靶細胞的自然釋放對照管，每份標本和對照管均設3個復管，每管均用完全RPMI-1640培養液補足體積至1ml，混勻，離心1500r/min，2min，以促進效-靶細胞作用，置37℃，5%CO2溫箱中培養18h。

4. 酶處理：取出效/靶細胞培養物，1500r/min離心2min，棄上清，于每管中加入胰蛋白酶和DNA酶各0.1ml，混勻后置37℃水浴30min，促使已受損傷的靶細胞釋放125I-UdR，然后于各管中加入0.8ml冷Hanks液，以終止酶反應。1500r/min離心2min，分別吸出各管上清0.5ml置于另一個塑料試管中。

5. 放射性測量和結果計算：用γ-計數儀分別測量每管上清和細胞部分的cpm值，并按下式計算125I-UdR釋放率和NK細胞活性，取三管均值作為NK細胞活性。

125 I-UdR釋放率（%）= （0.5ml上清cpm值×2）/（0.5ml上清cpm值+0.5ml細胞懸液cpm值）×100％

NK細胞活性（%） =試驗管125 I-UdR釋放率 - 對照管125 I-UdR自然釋放率。

一般要求125I-UdR自然釋放率<10％，檢測小鼠脾細胞NK活性用YAC-1細胞作為靶細胞時，檢測前可不經過酶處理。

1. 該標記法需要長時間的孵育，用酶處理可增加方法的敏感性。

2. 要獲得較理想的結果，關鍵在于對靶細胞標記前的代傳處理。使細胞處于對數增長期的活力最佳狀態，以達到最適的標記率和增強細胞對放射性同位素毒性作用的抗力，從而降低自然釋放。

3. 因為如果發生污染就要丟棄培養的細胞，重新開始。

1. NK活性計算：

同位素釋放%（NK活性）=（實驗組cpm一自然釋放cpm）/（最大釋放cpm一自然釋放cpm）X100

自然釋放%=（自然釋放cpm/最大釋放cpm）x100

此結果中列出的同位素釋放%,即代表NK活性。

2. 目前常用鉻酸鈉（Na51cro4）及125I一脫氧尿嘧啶核苷（125I-UdR）標記祛，兩種方祛各有利弊。

51Cr優點：敏感、簡便、流程短、重復性好，缺點為半衰期短、自然釋放高。

125I-UdR優點：半衰期長、自然釋放低、適于孵育時間較長的實驗。缺點為敏感性較低、流程長。