瓊脂糖凝膠電泳實驗

用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。

瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現廣泛應用于核酸的研究中。

蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6——9之間，離子強度0.02——0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100 bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20 kb，利用脈沖電泳，可分離高達107 bp的DNA片段。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。

DNA                                                          

瓊脂糖                                                                  TBE電泳緩沖液                                                                  電泳載樣緩沖液                                                                  溴化乙錠(EB)溶液母液                                                                  DNAGreen                                                          

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一、試劑配制

1.  5×TBE緩沖液：450 mmol/L Tris-硼酸，10 mmol/L EDTA，pH值8.0。使用時將上述儲存液稀釋10倍至0.5×TBE緩沖液，可同時作為電泳及制膠用的緩沖液。

二、制膠

1.  根椐制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準確稱量的瓊脂糖粉（總液體量不宜超過錐瓶的50%容量）。

2.  在錐瓶的瓶口上蓋上保鮮膜或牛皮紙，并在膜或紙上扎些小孔，然后在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。加熱時，當溶液沸騰后，請戴上防熱手套，小心搖動錐瓶，使瓊脂糖充分均勻溶解。此操作重復數次，直至瓊脂糖完全溶解。

3.  使溶液冷卻至50℃-60℃左右，如需要可在此時加入溴化乙錠溶液（終濃度0.5  μg/ml）或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混勻。

4.  將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3~5 mm之間。制膠模如下圖所示，小膠倒入25-30 mL左右瓊脂糖溶液，大膠則60-70 mL左右，若需切膠回收，凝膠可適當加厚。

5.  在室溫下使膠凝固，大約30分鐘~1小時。

三、上樣

1.  取適量樣品與6×上樣緩沖液混勻（如：1 μl樣品與5 μl 6×上樣緩沖液），用微量移液槍小心加入樣品槽中。

2.  上樣量根據樣品濃度可適當調整，若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量（一般小孔40 μl 為上限，大孔200 μl 為上限，具體和制膠膜規格相關）。

3.  每加完一個樣品要更換槍頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。

四、電泳

1.  加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在110 V，電流在40 mA以上。

2.  當條帶移動到距凝膠前沿約2 cm時（約40 min），停止電泳。

3.  紫外下拍照并觀察。

1.  5×TBE緩沖液放置時間過久會沉淀，因此一次性不要配太多。工作用電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液，取5×TBE緩沖液貯存液稀釋，現配現用。

2.  用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統一。

3.  瓊脂糖粉在微波爐中加熱時間不宜過長，每次當溶液起泡沸騰時停止加熱，否則會引起溶液過熱暴沸，造成瓊脂糖凝膠濃度不準，也會損壞微波爐。溶解瓊脂糖時，必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會造成電泳圖像模糊不清。

4.  凝膠不立即使用時，請用保鮮膜將凝膠包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。

瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍

瓊脂糖濃度    最佳線形DNA分辨范圍（bp）

0.50%           1 000～30 000

0.7%             800～12 000

1%                500～10 000

1.20%           400～7 000

1.50%           200～3 000

2%               50～2 000

2%～5%       20～1 000